特发性肺纤维化病因不明,中位生存时间仅3年左右,肺 移植是目前唯一有望提供长期生存的方法。由于部分研究结 论难以从临床患者中得到,肺纤维化动物模型便成为研究人 类特发性肺纤维化的有力工具^〔1〕。20世纪70年代初,Snider 等^〔2〕首次用博莱霉素造模成功,由于该模型病理学特点与人 类特发性肺纤维化十分相似,目前成为国内外公认的用于研 究人类肺纤维化的动物模型。Ⅰ 、Ⅲ 型胶原是肺组织中的主 要胶原成分,也成为评价博莱霉素肺纤维化模型的特异指 标^〔3〕。本实验采用天狼猩红- 偏振光法,结合图像分析系统 定量检测博莱霉素大鼠肺纤维化不同时间点Ⅰ 、Ⅲ 型胶原纤 维的表达规律。

Wistar大鼠48 只,SPF 级,雄性,体重( 180±20) g (军事医学科学院实验动物中心)。

博莱霉素A₅,批号070501,粉剂,8 mg /支 ( 天津太和制药有限公司); F3B200 天狼腥红(美国M obay 公 司) ; N ikon E600POL 偏振光显微镜,图像分析软件( 美国 M ed ia Cybernetics公司) 。

将大鼠随机分为对照组和博莱 霉素组,每组24只; 分7,14,28 d 3个时间点处死。气管暴露 法建立肺纤维化大鼠模型,无菌条件下大鼠气管内一次性注 射博莱霉素A₅ ( 5 mg /kg ),同法对照组大鼠气管内注入等体 积生理盐水。

每组分3个时间点分 别取8只大鼠腹主动脉放血处死。取肺组织用4%多聚甲醛 固定,制作石蜡切片,厚度4 μm。苏木素- 伊红(H E)染色和 天狼猩红染色。

每只动物随机 观察1张切片,放大倍数为10×10,每张切片随机选取上、 下、左、右、中5个视野,偏振光显微镜下观察,图像分析系统 对Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达进行定量分析,用阳性区域面积百分比 代表胶原含量^〔4〕。

采用SPSS 161 0软件进行双因素多水平设 计方差分析,处理因素间两两比较采用最小显著差( LSD)法。 以α= 0105作为检验水准。

造模后第7 d,大鼠肺 组织肺泡及肺间质巨噬细胞和淋巴细胞浸润,开始出现少量 成纤维细胞和胶原纤维。第14 d,肺泡隔增厚,巨噬细胞浸 润,淋巴细胞和成纤维细胞逐渐增多。第28 d,部分正常肺泡 结构破坏,出现大量成纤维细胞、淋巴细胞和泡沫细胞以及胶 原纤维。结果表明,博莱霉素大鼠肺纤维化模型成立。

对照组大鼠 肺组织结构未见明显异常。建模后第7 d 肺泡隔明显增厚, 部分肺泡结构消失,大量绿色Ⅲ 型胶原之间夹杂少量黄、红色 Ⅰ型胶原,呈绳索状密集交织排列。第14 d时,肺泡结构紊 乱,红,黄色Ⅰ型胶原较前增加,分布在淡绿色交织状Ⅲ 型胶 原中间。第28 d时,桔红色的Ⅰ型胶原和绿色Ⅲ 型胶原纤维 较前增粗增多,二者呈网织状交错存在。

表 1

表 1 大鼠肺组织Ñ 型胶原面积百分比(x±s)

表 1 大鼠肺组织Ñ 型胶原面积百分比(x±s)

与对照组比较, 博莱霉素组各时间点Ⅰ型胶原面积百分比均明显增加( P < 0.01) 。在博莱霉素组,与相邻前一个时间点比较,14和28 d 组大鼠肺组织Ⅰ型胶原面积百分比明显增加( P < 0.01,P < 0.05)。大鼠气管内注入博莱霉素能够增加其肺组织Ⅰ型胶 原的表达,且随着时间进展,Ⅰ型胶原进行性增加,第28 d时 达高峰。

表 2

表 2 大鼠肺组织Ó 型胶原面积百分比(x±s)

表 2 大鼠肺组织Ó 型胶原面积百分比(x±s)

第7,14和28 d 时,博莱霉素组Ⅲ 型胶原面积百分比明显高于对照组( P < 0.01)。在博莱霉素组,与相邻前一个时间点比较,14和28 d 组大鼠肺组织Ⅲ 型胶原面积百分比明显增加( P < 0.01)。气 管内注入博莱霉素能够增加其肺组织Ⅲ 型胶原的表达,且随 着时间进展,Ⅲ 型胶原进行性增加,第28 d时达高峰。

目前评价博莱霉素大鼠肺纤维化模型的主要标准是对肺 组织进行病理组织学评价,其次还有肺系数、胶原蛋白及纤维 蛋白的代谢产物含量的测定等^〔5〕。这些方法由于检测方法 自身的限制,存在检测程序复杂、结果不够直观等问题。本实 验发现,博莱霉素可诱导大鼠肺组织成纤维细胞增生,产生大 量胶原,早期以Ⅲ 型胶原为主,晚期以Ⅰ型胶原增生为主,呈现时间递增关系,28 d时达高峰。天狼猩红- 偏振光法观察 到胶原动态变化过程与H E染色结果相互吻合,同时肺组织 羟脯氨酸含量与胶原面积存在很好的相关性^〔5〕。因此,天狼 猩红- 偏振光法作为检测肺组织中Ⅰ、Ⅲ 型胶原的定量方法, 与羟脯氨酸测定法和免疫组化法比较,具有直观简便的优点, 可用于评价博莱霉素大鼠肺纤维化动物模型及抗肺纤维化药 物的疗效。