2010, Vol. 26
人类腺病毒( Adenov irous)是一种可广泛引起呼吸道、胃 肠道、泌尿系统及眼部等身体多个器官疾病的重要病原体,对 人类健康危害较大。腺病毒血清型众多,目前可分为A-G7 个亚属,52个血清型〔1〕。传统的检测方法包括病毒分离鉴 定、免疫荧光和普通PCR 等。本研究将PCR 和荧光检测相 结合,建立了一种快速、通用、简便的腺病毒双链嵌合荧光染 色( SYBR G reen) 实时定量PCR 检测法,对理论快速检测腺 病毒暴发疫情具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 标准毒株和细胞株来源腺病毒3,7,11型标准毒株、A 型和B型呼吸道合胞病毒( RSV)、Ⅰ ~ Ⅳ型副流感病毒( 美 国标准生物品收藏中心); 甲3、甲1 和乙型流感病毒及H ep-2 细胞株(中国疾病预防控制中心)。
1.2 临床标本采集浙江省咽结膜热暴发疫情中采集的咽 拭子标本和浙江大学附属儿童医院呼吸道门诊就医患儿的咽 拭子标本,共84份,每份标本均进行SYBR Green 荧光定量 PCR、普通PCR和病毒分离。
1.3 病毒DNA 提取取临床标本或病毒细胞培养物200 LL,用高纯度病毒核酸提取试剂盒( 罗氏公司) 提取病毒 DNA。
1.4 引物序列上游引物序列5'-GACATGACTTTCGACTTCGATCCCATGGA- 3', 下游引物序列5'-CCGGCTGAGAA GGGTGTGCGCAGGTA-3', 扩增产物长139 bp〔2〕,引物由美国 Inv itrogen 公司合成,该引物对同时用于荧光定量PCR 和普通 PCR检测。
1.5 PCR 反应体系和反应条件采用QuantiTec t SYBR Green PCR试剂盒(德国Q iagen公司),在M J Option 2荧光定 量PCR 仪(美国B ioRad 公司) 上进行反应。反应体系: 2 @ m aster m ix 121 5 μL,上下游引物各015 μL,样本101 0 μL,去 离子水补充至总体积为25 μL。反应条件: 95℃15 m in 后, 94℃15 s,52℃30 s,72℃30 s,检测荧光信号共40个循环。 熔解曲线分析: 以011℃/ s的变化速度从55~ 95℃,温度 每增加01 2 e 读取荧光值1次,保持10 s。
1.6 特异性评价SYBR Green 荧光定量PCR 分别检测 甲3、甲1 和乙型流感病毒、A型和B型RSV、Ñ ~ Ô 型副流感 病毒等其他常见呼吸道病毒,以评价该检测方法的特异性。
1.7 敏感性和重复性评价将含有hexon基因片段的重组质 粒,稀释成1×106 拷贝/μL,分装后-20℃保存。使用前10 倍梯度稀释成1×101 拷贝/μL,以检测结果阳性的最高稀释 度的质粒浓度作为评价敏感性的指标。重复3次实验,计算循 环阈值( CT值)均数和变异系数以评价方法的重复性。
1.8 标准曲线制作以1×106 ~ 1×102 拷贝/μL 的质粒为 模板进行荧光定量PCR,根据质粒拷贝数的对数和CT 值生 成标准曲线。
2 结果 2.1 SYBR G reen荧光定量PCR特异性对其他常见呼吸道 病毒进行检测均未出现阳性扩增曲线,表明该方法与其他呼 吸道病毒间无交叉反应,具有良好的特异性。
2.2 SYBR G reen荧光定量PCR敏感性(图 1) | 注: A: 106 拷贝/μL; B: 105 拷贝/μL; C: 104 拷贝/μL; D: 103拷贝/μL; E: 102 拷贝/μL; F: 10 拷贝/μL。 图 1 腺病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的敏感性评价 |
以1×106 ~ 1 × 10拷贝/μL的质粒为模板进行荧光定量PCR的结果表 明,1×106 ~ 1×102 拷贝/μL的质粒扩增结果均为阳性,而1×10拷贝/μL的质粒为阴性,因此,该检测方法的灵敏度为 1×102 拷贝/μL。
2.3 SYBR Green荧光定量PCR重复性(表 1) | 表 1 腺病毒SYBR Green荧光定量PCR 重复性评价 |
对1×106 ~ 1×102 拷贝/μL 5个稀释度的质粒模板重复3次实验,对每 组CT值计算均数、标准差和变异系数,结果每个稀释度的CT 值变异系数均 < 2%,证明该方法具有良好的重复性。
2.4 熔解曲线分析(图 2) | 图 2 腺病毒SYBR Green 荧光定量PCR 熔解曲线分析 |
腺病毒hexon 基因扩增产物在熔 解曲线上只出现1 个单一的峰,其对应的Tm 值为( 841 9± 011)℃。荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,在139 bp处有一特异性条带。因此,经熔解曲线分析可判断SYBR Green荧光定量PCR产物的特异性。
2.5 标准曲线的建立以1×106 ~ 1×102 拷贝/μL的质粒 为模板进行荧光定量PCR反应,以质粒浓度的对数值为纵坐 标,CT值为横坐标得到的标准曲线方程式为: y = - 01 28x + 101 38,R2 = 01997,建立腺病毒核酸定量分析模型,根椐标准 曲线可将待测样本的CT值换算为拷贝数而进行定量分析。
2.6 临床样本检测结果用SYBR Green荧光定量PCR 方 法检测84份临床样本,共检测出26份阳性样本,阳性率为 30.95%。普通PCR 检测结果与荧光定量PCR 一致。经 H ep-2 细胞分离,共分离出11 株病毒,分离阳性率为 13.10%,经PCR和测序鉴定为腺病毒。病毒分离阳性者均 为核酸检测阳性样本。
3 讨论SYBR Green 荧光定量PCR 不需要设计和合成探针,操 作简便,成本低,能满足普遍需要〔3, 4〕。另外,探针法要求探 针与目的片段DNA 序列必须完全同源,对血清型别多、基因 变异大的腺病毒来说要设计一种通用的探针法非常困难。应 用SYBR Green 染料法既解决了此难题又能实现荧光信号检 测,利用该对引物能够检测各种常见的腺病毒血清型〔5〕。但由 于荧光染料能与任何双链DNA结合,需要通过熔解曲线分析 对反应产物的特异性进行鉴定〔6〕。本检测方法熔解曲线峰单 一,并同时对流感、副流感和呼吸道合胞病毒( RSV )等进行了 检测,结果均阴性,说明该方法具有很高的特异性。本研究还 对3种检测方法的结果进行了比较,荧光定量PCR 与常规 PCR的结果一致,但操作的简便性和自动化程度前者明显优于 后者。病毒分离的阳性率仅为13110%,低于核酸检测。
本研究建立了腺病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方 法,具有快速、敏感、特异、通用、成本低及可定量等优点,为腺 病毒感染的早期诊断提供了有效的技术手段。
| 〔1〕 | Louie JK,Kajon AE,Holodniy M,et al. Server pneumonia due to adenovirus serotype 14:a new respiratory threat?[J].Clin Infect Dis,2008,46(3):421-425. |
| 〔2〕 | Echavarria M,Forman M,Ticehurst J,et al. PCR method for detection of adenovirus in urine of healthy and human mimunodef iciency virusin fected individuals[J].J C lin M icrob iol, 1998,36(11):3323-3326. |
| 〔3〕 | Pizzato M,Erlwein O,Bonsall D.A one-step SYBR Green-Ibased produc-tenhanced reverse transcrip tase assay for the quantitation of retroviruses in cell culture supernatants[J].J Virol Methods,2009,156(1-2):1-7. |
| 〔4〕 | 罗予,卞广林.脆弱类杆菌荧光定量PCR法检测[J].中国公共卫生,2007,23(1):100-101. |
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| 〔6〕 | Steer PA,Kirkpatrick NC,OpRourke D,et al. Class ification of fowl adn eovirus serotyp es by use of h igh-resolut ion m elt ing-cu rve ana lysis of the hexongene region[J].J Cl in Microbiol, 2009,47(2):311-321. |