随着锂盐应用的增多,锂的生物学作用逐渐为人们所认 识。巨噬细胞是机体的重要防御细胞,在抗感染、抗肿瘤及免 疫调节中起重要作用,能通过多种途径介导肿瘤免疫,破坏和 清除肿瘤细胞,增强的生成活性氧和一氧化氮的能力^[1]。近 年来研究结果表明,锂有神经营养和神经元保护作用,可拮抗 多种因素,锂盐对免疫细胞功能的增强作用。锂盐增强人自 然杀伤( NK )细胞活性,但对大鼠的NK 细胞及多形核白细胞 的吞噬作用却有抑制作用。为了解氯化锂( L iC l)对巨噬细胞 功能影响,本研究巨噬细胞加载不同浓度的氯化锂,观察L iC l 对巨噬细胞巨噬功能、产生NO,O^-2及H₂O₂ 能力的影响,为 锂盐的治疗机制提供实验依据。

F12 培养基( 美国Promega 公司); 脂多糖 ( LPS,上海西唐科技公司); 辣根过氧化物酶( 美国S igm a 公 司) ; 细胞色素C ( 美国Sigm a 公司); 二甲基亚砜( D im ethy l sulfox ide,DMSO); 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,南京卓尔生化技 术有限公司); 胎牛血清( feta l ca lf serum,FCS); Gr iess检测试 剂盒(美国Prom eg a公司); 酶标仪(美国B io-RAD公司); LiC l (上海中锂实业有限公司)。

昆明种小鼠(江苏大学动物中心) 80 只,体重20~ 22 g,雌雄各半,随机分为4个组,每组20 只。 其中3组每天给予L iC l 014,01 6,112 mg / ( kg· bw ) 连续灌胃 20 d,另1组不作处理为对照组。

于实验前3 d给小鼠腹 腔注射3%硫乙醇酸钠2 mL。实验当天处死小鼠,用酒精消 毒腹部,剪开小鼠腹部皮肤,向腹腔内注射无菌磷酸盐缓冲液 ( PBS) 2 mL,轻揉小鼠腹部后,将液体吸出,再用PBS 冲洗2 次,进行细胞计数,分别用F12培养液及PBS 缓冲液调整细 胞浓度为1 × 10⁶ /mL。

取1 mL 1 × 10⁶ /mL腹腔巨 噬细胞加入24孔板内,置37 ℃ 、5% CO₂ 条件下贴壁2 h,取 出弃上清,漂洗,再加入01 1% 中性红生理盐水液1 mL ,置 37 ℃ 、5% CO₂ 条件下培养20 m in,取出,弃上清漂洗,加入1 mL细胞溶解液(乙醇B乙醇/1:1),充分溶解后于540 nm 波长 处比色。抑制率(% ) = ( 1- 实验组的吸光度变化值/对照组 吸光度变化值) × 100%。

取1 mL 1 × 10⁶ /mL小鼠腹腔巨 噬细胞加入24孔板内,置37 ℃ 、5% CO₂ 培养箱中贴壁2 h,弃上清,漂洗后再每孔加入1 mL F12,同时加入LPS 使其终 浓度为5 Lg /mL。置37 ℃ 、5% CO₂ 条件下培养24 h,取出上 清至试管内,向试管中加入1 mL 格里斯( Gre iss) 试剂( 011% N- a-萘基乙二胺,1% 磺胺,3% H₃ PO₄ ) ,显色10 m in,于450 nm 波长下进行比色。

取0.7mL 1 × 10⁶ /mL 小鼠腹腔巨噬细 胞,加入0115mL( 1 m g /mL)辣根过氧化物酶,01 15 mL( 1 mg / mL)酚红液,011 mL( 10 m g /mL) 经血清调理后的酵母聚糖,于37 ℃ 水浴2 h 取出,置于冰浴中,经2 000 r /m in 离心10 m in,取上清加入PBS 2 mL,再加入4 m o l/L NaOH 40 LL,于 610 nm 波长下比色。

取1 mL 1 × 10⁶ /mL小鼠腹腔巨噬细胞,于 37 ℃ 保温5 m in,加入011 mL( 10 m g /mL)经调理后的酵母聚 糖,再加入细胞色素C使其终浓度为( 60 Lm o l/L)。于37 ℃ 水浴2 h取出,置于冰浴中,再于2 000 r /m in离心10 m in,取 上清加入PBS 1 mL,于550 nm 波长下比色。

采用Stata 710统计软件进行F 检验。

在LiC l 01 4,01 6,112 mg /( kg· bw )连续灌胃染毒20 d后,细胞总数分别 为( 10. 4± 2. 4),( 10. 8 ± 3. 6) ,( 10. 6 ± 2. 3 ) × 10⁶ /mL,与对 照组( 14. 2 ± 4. 2) × 10⁶ /mL比较,差异有统计学意义( P < 0.05),组间差异无统计学意义(P > 0.05) 。

表 1

表 1 不同剂量LiC l对小鼠腹腔巨噬细胞吞 噬功能的影响(x± s )

表 1 不同剂量LiC l对小鼠腹腔巨噬细胞吞 噬功能的影响(x± s )

表 1 可见,由于对小鼠腹腔注射,剂量过高、时间长等因素,导致部 分动物死亡。出现不同剂量L iC l对腹腔巨噬细胞的吞噬功 能有不同程度的影响,且随剂量增加,抑制率也逐渐增高,呈 剂量- 反应关系; 与对照组比较,差异有统计学意义( P < 0.05),组间差异也有统计学意义(P < 0.05) 。

表 2

表 2 不同剂量L iC l对小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、O-2 和H2O2 影响(x± s, n= 5)

表 2 不同剂量L iC l对小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、O-2 和H2O2 影响(x± s, n= 5)

表 2可 见,3种不同L iC l染毒剂量,对巨噬细胞生成NO能力都产 生抑制,与对照组比较差异均有统计学意义( P < 0.05) ,剂量 组之间比较,差异有统计学意义( P < 0.01)。同时对巨噬细 胞产生O^-2的能力产生抑制,与对照组比较差异有统计学意 义,且随剂量的增高,O^-2产生逐渐下降( P < 0.05 )。11 2 mg /( kg· bw )对巨噬细胞产生的H₂O₂ 出现明显抑制,与对照 组比较差异有统计学意义。而0.4,0.6 m g / ( kg· bw ) 组的 L iC l未见明显抑制,但随剂量的增高,H₂O₂ 产生的量逐渐减 少( P < 0.01) 。

本实验结果表明,在3种剂量作用下,巨噬细胞的吞噬功 能均受到明显抑制。吞噬功能却呈剂量- 反应关系,表明在 本试验条件下吞噬功能损伤细胞数的减少。同时研究发现 L iC l在3种剂量下,LiC l均对小鼠腹腔巨噬细胞生成NO 能 力产生抑制作用。本实验L iCl对巨噬细胞产生NO 能力的影 响,可能直接抑制其在机体内发挥各种杀伤异物,体内活性氧 不断产生,也不断被体内抗氧化系统清除,保持动态平衡状态 ^{[5, 6]}。超氧阴离子自由基( O^2- ) 是多种自由基的派生源,当 O^2- 生成过多或清除不足时,O^2- 及其衍生物就可以直接损伤 细胞。对小鼠腹腔巨噬细胞产生O^-2的能力产生抑制。而在 112 mg /( kg· bw )时,巨噬细胞产生的过氧化氢( H₂O₂ )量也 明显受到抑制。结果表明,发现O^-2下降速度快,即在低剂量 014 mg /( kg # bw ) 出现抑制作用,而H₂O₂ 则在11 2 mg /( kg· bw )时观察到明显抑制。推测在较低剂量时,O^-2产 生受到明显抑制,但由于其他一些还原剂如还原型细胞色素 C,还原型谷胱甘肽的存在,使已产生的O^-2可转化为H₂O₂,因而H₂O₂ 抑制不如O^-2明显,而随单O^-2进一步降低,同时 巨噬细胞还参与免疫、炎症反应的重要机制。随单核细胞发 育成巨噬细胞,其生成O^-2的能力逐渐降低。因此,出现 H ₂O₂ 产量降低,可能与LiC l剂量有关。但具体抑制机制有 待进一步研究。