生物活性肽( b ioac tive peptides) 是指对生物体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。相对于蛋白质,活性肽分子小,但生物活性高,少量的肽就能发挥非常重要的生理作用^〔1〕。本实验室之前的研究发现,以无污染的深海鱼肉组织为原料,采用生物酶解的方法产生的海洋蛋白肽(M a rine pro tein pep tide,M PP) ,具有增强小鼠免疫功能的作用^〔2〕。此外,许多研究发现,单独给予核苷酸( N uc leo tides,NT ),也具有增强机体免疫力的作用^{〔3, 4〕}。因此,本研究探讨M PP和 NT配伍剂对小鼠的免疫调节作用及其作用机制,旨在为新型保健食品的开发提供科学依据。

海洋蛋白肽( 北京中食海氏生物技术有限公司) ; 核苷酸( 5 'AMP:5' CMP:5'GMPNa₂ :5'UMPNa₂ = 22.8: 25.8:30.2:20.4) ( 大连珍奥集团股份有限公司)。

Balb/ c 健康雌性小鼠,清洁级,合格证号: SCXK(京) (北京大学医学部实验动物中心); 6~ 8周龄,18~ 22 g。共160只,分为4批进行实验,每批随机分为4组,每组 10只。实验Ñ 批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、半数溶血值( HC₅₀ )的测定和抗体生成细胞数的测定; 实验Ò 批进行碳粒廓清实验; 实验Ó 批进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验; 实验Ô批进行刀豆蛋白A ( ConA )诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、杀伤细胞( NK )活性、脾脏T淋巴细胞百分比和血清免疫球蛋白水平测定。

B io-Rad 酶标仪( 美国B io-Rad 公司); 二氧化碳培养箱( 日本SANYO 公司); FACSCa libur型流式细胞仪(美国BD公司) 。刀豆蛋白( ConA )、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、琼脂糖、十二烷基硫酸纳( SDS ) ( 美国Sigm a 公司); 胎牛血清、RPM I 1640培养液(美国H y clone 公司); 藻红蛋白( PE)标记的抗小鼠CD4单抗、别藻蓝蛋白( APC) 标记的抗小鼠CD8单抗、异硫氰酸荧光素( FITC )标记的抗小鼠CD3 单抗(美国Inv itrog en公司) ; 绵羊红细胞( SRBC ) ( 北京大学医学部实验动物中心) ; 免疫球蛋白试剂盒( 北京德易生物医学技术有限公司)。其余试剂均为分析纯。

海洋蛋白肽(MPP)的推荐剂量为成人( 按60 kg 体重计) 每日217 g,相当于0.045 g / ( kg· bw )。核苷酸( NT) 的成人每日推荐摄入量为核苷酸 0.020 g /( kg· bw )。按照2个受试物单独作用的最佳剂量^〔2〕 配伍设核肽混合中剂量组,再上下各设一核肽混合高和低剂量组,另设一空白对照组。空白对照组: 给予普通饲料; 高剂量组: 0.120 g /( kg· bw ) 核苷酸+ 0.675 g / ( kg· bw )海洋蛋白肽,即每100 g饲料含NT和M PP各01 120和0. 675 g; 中剂量组: 0.040 g /( kg· bw) 核苷酸+ 0.225 g / ( kg· bw ) 海洋蛋白肽,即每100 g 饲料含NT和MPP各0.040和0.225 g; 低剂量组: 0.013 g / ( kg· bw )核苷酸+ 0.075 g / ( kg· bw ) 海洋蛋白肽,即每100 g饲料含NT和MPP各0.013和0.075 g。

实验动物饲养于北京大学医学部实验动物中心二级动物室,温度20 ~ 25 ℃ ,相对湿度40% ~ 50%,24 h人工昼夜( 7~ 19时昼,19 ~ 7 时夜) 。各组小鼠喂饲不同饲料4周后,称重后颈椎脱臼处死,各免疫调节指标测定按5保健食品功能学评价程序及检验方法6中免疫调节功能的评价方法^〔5〕进行。

实验4周后,小鼠颈椎脱臼处死,取脾脏,磨碎,过滤( 200 目) ,洗涤,裂解红细胞,悬浮,制备成细胞浓度为1×10⁶ 个/mL脾细胞悬液。每份样品编3 支试管,每管加上述脾单细胞悬液1 mL,离心弃上清,加1 mL磷酸盐缓冲液( PBS ) ( pH 71 0) 洗涤2次,再按组分别加入荧光标记的抗小鼠的各种CD单克隆抗体(按试剂说明书操作),室温( 18~ 25℃ ) 避光孵育15 m in,进行染色。然后再用PBS 洗2次,加入PBS 300 LL,上机,按使用说明书用流式细胞仪检测各细胞群百分比。

血清中免疫球蛋白IgG、 IgM、IgA的测定,采用琼脂内单向免疫扩散法。

采用SPSS 1110统计软件进行方差分析。

表 1

表 1 海洋蛋白肽和核苷酸配伍剂对小鼠各项免疫功能指标的影响(x± s )

表 1 海洋蛋白肽和核苷酸配伍剂对小鼠各项免疫功能指标的影响(x± s )

由表 1可见,经口给予小鼠不同剂量的混合物4周后,与正常组比较,混合物低剂量组能明显增强ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化能力(P < 0.05),中、低剂量组能明显增强小鼠迟发型变态反应能力( P < 0.05),能明显提高小鼠抗体生成细胞数( P < 0.05)。

表 2

表 2 海洋蛋白肽和核苷酸配伍剂对小鼠免疫球蛋白分泌的影响(x± s, mg/ g)

表 2 海洋蛋白肽和核苷酸配伍剂对小鼠免疫球蛋白分泌的影响(x± s, mg/ g)

由表 2 可见,经口给予小鼠不同剂量的混合物4周后,与正常对照组比较,低剂量组的血清免疫球蛋白 IgG、IgM 和IgA水平均明显升高( P < 0.05),即二者配伍具有增加抗体生成作用。

表 3

表 3 海洋蛋白肽和核苷酸配伍剂对小鼠脾脏 淋巴细胞群百分比的影响(x± s)

表 3 海洋蛋白肽和核苷酸配伍剂对小鼠脾脏 淋巴细胞群百分比的影响(x± s)

由表 3可见,给予不同剂量混合物4周后,与对照组比较,低剂量组的小鼠脾脏CD4⁺ T细胞亚群百分比明显增加( P < 0.05) ; 3 个剂量组的脾脏细胞CD4⁺ / CD8⁺ 的比值均明显增加(P < 0.05); 高剂量组的脾脏CD8⁺ T 细胞亚群百分比明显降低(P < 0.05)。提示混合物可能通过增强CD4⁺ T 辅助细胞( Th细胞)功能,以及抑制CD8⁺ T 抑制细胞( T s细胞)功能而实现增强免疫功能的作用。

本研究海洋蛋白肽是以无污染的深海鱼肉组织为原料,采用生物酶解的方法生产,由2~ 6个氨基酸组成、分子量范围在200~ 1 000 D 的小分子混合寡肽类。而核苷酸是以蔗糖糖蜜为原料发酵提取RNA,再经酶降解生产的纯度在99% 以上的5'核苷酸混合物。

本实验室之前的研究发现,单独给予MPP或NT,均具有增强免疫力的作用^〔2〕。本次研究发现,经口给予小鼠不同剂量的M PP或NT配伍剂4周后,能够增强小鼠的细胞免疫及体液免疫功能,且混合物的最佳剂量低于二者单独作用的剂量,提示二者具有一定的协同作用。

研究证实,T淋巴细胞亚群是反映机体免疫系统内环境稳定状况的重要指标^〔8〕。本实验中,三标染色流式细胞仪测定小鼠脾T 淋巴细胞亚群发现,M PP和NT 配伍剂可能通过增强CD4⁺ T辅助细胞( Th细胞)功能而实现增强免疫功能的作用。此外,补充配伍剂后可明显增加血清免疫球蛋白IgG、 IgM 和IgA的水平,提示配伍剂可能通过促进体内抗体生成从而提高机体免疫功能,但其作用机制有待进一步研究。