2010, Vol.26
2.长治医学院附属和济医院内科;
3.郑州大学第三附属医院妇产科
DNA 修复基因与癌基因,抑癌基因并称为三大肿瘤相关 基因,而DNA聚合酶B( DNA polβ)在DNA 修复中的作用 和其表达特征,成为当今肿瘤分子机制研究的一个热点,它从 DNA 损伤修复的角度去探讨肿瘤的病因〔1〕。自2002年本课 题组利用反转录-聚合酶链式反应( RT-PCR )、单链构象多态 性( SSCP) 和序列分析研究发现了人食管癌中存在着polβ 的突变,其中,177~ 234n,t 58 bp缺失突变( de le tion m uta tional type,dm t)为食管癌中的热点突变形式〔2〕。本研究将这种类型 的polβ、野生型polβ与增强型绿色荧光蛋白( EGFP)构建了 真核表达载体,通过转染小鼠成纤维细胞( N IH3T3细胞),观 察polβ基因过表达的融合蛋白的定位及其对细胞增殖特性 的影响,进一步阐明DNA polβ在食管癌发生发展中的作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要仪器与试剂CK40- 32NFL 荧光倒置显微镜 ( 日本OLYMPUS 公司)。小提质粒试剂盒(美国Q iagen 公 司) ; RPM I1640培养基、转染用脂质体L ipofectam ine、抗生素 G418(美国G IBCO 公司); 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT) (美国 S igm a公司); 细胞周期试剂盒(美国BD公司); 胎牛血清、培 养瓶、培养板(美国Cor ing 公司)。
1.1.2 细胞小鼠成纤维细胞系NIH3T3(武汉细胞典藏中心)。
1.2 方法 1.2.1 载体构建按参考文献122方法构建。
1.2.2 质粒提取含野生型和缺失突变型polβ的重组真核 绿色荧光表达载体pEGFP-C3-polβ的DH 5A菌,LB液体培养 基过夜培养,按照试剂盒说明提取质粒,并检测其浓度。
1.2.3 细胞培养和基因转染NIH3T3细胞用含10%胎牛血 清、100 μg /mL链霉素、100 U /mL青霉素的RPM I1640培养液 在37℃、5% CO2 饱和湿度条件下培养传代。按4×104 /孔细 胞数接种于24 孔板,当细胞汇合度达50% ~ 60%,分别将 1Ll的野生型和缺失突变型重组质粒pEGFP-C3-polβ和1LL 空质粒pEGFP-C3分别与无血清无双抗的RPM I1640培养基 100 μL混合,1 μL脂质体L ipo fectam ine 与无血清无双抗的 RPM I1640培养基100 μL混合,混匀,然后将上述2种液体混 合,室温静置30 m in,用无血清无双抗的RPM I1640培养基冲 洗每孔细胞2次,加质粒脂质体混合物200 μL 于每孔细胞, 37℃、5% CO2 饱和湿度条件下培养5 h,吸去每孔混合物,加 10%胎牛血清( FBS),含双抗的RPM I1640 培养基1 mL,37℃、5% CO2 饱和湿度条件下继续培养,转染后的野生型、缺 失突变型和空质粒细胞表示为NIH 3T3-EGFP-w t-polβ, N IH 3T3-EGFP-dm t-polβ,N IH 3T3-EGFP。48 h 后加G418 1200 μg /mL筛选,每3 d换1次液,共筛选3周,最后1 周将 加至1 500 μg /mL,收集阳性克隆,用G418 200 μg /mL维持培 养。
1.2.4 形态学观察荧光倒置显微镜动态观察转染后的野 生型和缺失突变型N IH 3T3-EGFP-w t-polβ,NIH 3T3-EGFPdm t-polβ,N IH3T3-EGFP细胞和未转染的N IH 3T3细胞。
1.2.5 RT-PCR 检测polβmRNA 的表达设计B-actin 上下 游引物: P1: 5'ATCAT GAAGTGTGACGTGGAC3', P2: 5'AACCGACTGCTGTCACCTTCA3' 。取未转染和转染后G418筛选3 周的细胞各1瓶,按Tr izol说明书抽提细胞总RNA,逆转录后 PCR扩增。PCR反应体系: 30μL 10×bu ffer 3μL,4×dNTP 1 LL,上下游引物各01 5μL,Taq酶01 5 U,逆转录产物5μL, B-actin上下游引物各01 5μL。PCR反应条件: 94℃预变性5 m in,94℃变性50 s,55℃退火50 s,72℃延伸55 s,25个循环 后72℃延伸5 m in。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,上 样量均为5μL。
1.2.6 各组细胞增值特性分析分别接种转染野生型和缺 失突变型pEGFP-C3-polβ重组质粒的对数生长期N IH 3T3 细 胞和转染pEGFP-C3的对数生长期N IH 3T3细胞于96孔板,2 ×103 /孔,每种设5个复孔,并设无细胞的一组为对照组,共6 块板,每天取一块板,加MTT 20 LL /孔,37℃ 、5% CO2 饱和 湿度条件下培养4 h弃去MTT混合液,加150 LL二甲基亚砜 ( DM SO ) /孔,水平震荡10 m in,至紫色颗粒完全溶解,酶标仪 490 nm 测A 值,时间为横坐标,A 值为纵坐标绘制生长曲 线。
1.2.7 野生型和缺失突变型polβ蛋白对细胞周期的影响 取对数生长期的未转染的N IH3T3细胞、转染野生型和缺失 突变型的pEGFP-C3-polβ 重组质粒NIH 3T3 细胞和转染 pEGFP-C3的N IH 3T3 细胞各1瓶,磷酸盐缓冲液( PBS) 洗2 遍,胰酶消化,终止消化后,800 g 离心3 m in,PBS洗2 次,加 2%多聚甲醛1 mL固定5 m in,800 g离心3 m in,重悬于PBS 中,计数,按照细胞周期测定试剂盒说明书操作,用流式细胞 仪对DNA进行定量分析。用M adfit LT fo rM ac 31 0软件进行 分析。
1.2.8 S期细胞比率(SPF)值和DNA 指数( DI) 值测定 参照文献〔4〕测定计算。
1.3 统计分析采用SPSS 1010 统计软件进行统计分析,生 长曲线数据、流式细胞仪测定参数运用多因素方差分析,率的 比较采用χ2 检验。
2 结果 2.1 形态学观察 2.1.1 细胞内定位用野生型、缺失突变型pEGFP-C3-polβ 和pEGFP-C3转染N IH 3T3细胞,得到NIH 3T3-EGFP-w tpolβ、 NIH 3T3-EGFP-dm tpolβ和NIH 3T3-EGFP细胞。在荧光显微 镜下发现,与未转染的N IH3T3细胞比较,pEGFP-C3-polβ 和 pEGFP-C3编码的蛋白均有GFP表达,即在488 nm 波长下发 出绿色荧光,说明转染成功。绿色荧光在转染后24~ 48 h 表 达最强,转染率达40%,在用G418筛选时,荧光逐渐减弱,大 约在转染后3周,荧光衰减至15%。所不同的是,N IH3T3- EGFP细胞激发出的绿色荧光在细胞核与胞浆中无明显差 别,整个细胞呈均匀绿色(图 1A ); N IH 3T3-EGFP-w tpolβ细胞 虽然整个细胞都可见绿色荧光,但细胞核内的荧光强度明显 较胞质中的强(图 1B,箭头所示为细胞核); N IH3T3-EGFPdm tpolβ细胞却与NIH 3T3-EGFP细胞相似,整个细胞均匀表 达绿色荧光(图 1C )。
 | 图 1 荧光显微镜下绿色荧光在N IH3T3细胞中的分布(转染后24h, 400×) |
 | 图 2 N IH3T3细胞中外源polβ基因表达的RT-PCR 鉴定 |
与未转染的N IH 3T3细胞比较,在 前一周N IH 3T3-EGFP细胞和野生型、缺失突变型的N IH3T3- EGFP-polβ细胞体积均有增大,细胞内颗粒状物质增多,随着 继续培养,每种细胞均恢复原状,但转染的3种细胞无明显差 别,而未转染的NIH 3T3细胞无此变化。
2.2 RT-PCR 产物鉴定将RT-PCR 产物与DNA 标准参照 物一同电泳,引物用polβ的上、下游引物,B- actin为内参,所 得的扩增产物为单一、特异性产物。N IH 3T3-EGFP-w t-polβ 的条带灰度值高于未转染的N IH 3T3 和N IH 3T3-EGFP, NIH 3T3-EGFP-dm t-polβ细胞的条带灰度值高于NIH 3T3-EG-FP,为细胞本身和外源缺失型的polβ条带。
2.3 各组细胞增殖速度变化未转染的NIH 3T3细胞比较, 第1~ 2 d NIH 3T3-EGFP细胞和NIH 3T3-EGFP-w t-polβ的生 长速度变化不大; 从第3 d 开始,N IH3T3-EGFP-dm t-polβ 细 胞的生长速度明显增快( P < 0105),到第6 d 较未转染的 N IH 3T3细胞和NIH 3T3-EGFP细胞明显增快( P < 01 05)。
2.4 各组细胞的细胞周期变化未转染的NIH 3T3 细胞、 N IH 3T3- EGFP 细胞、NIH 3T3-EGFP-w t-polβ 细胞、NIH 3T3- EGFP-dm t-polβ细胞的S期细胞比例分别为571 35%,581 12 %,571 18%,681 29%,与其他组比较,缺失突变型polβ转染 的N IH3T3细胞S期细胞明显增多( P < 0105)。
2.5 细胞各组间DI和SPF值的变化比较各组的DI 值和 SPF值发现,各组的DI值无明显差别,均为近二倍体细胞; N IH 3T3-EGFP-w t-polβ细胞的SPF 值与NIH 3T3 和NIH 3T3- EGFP无明显差别; 而N IH3T3-EGFP-dm t-polβ细胞的SPF值 较N IH3T3 和NIH 3T3-EGFP明显增高( P < 01 05)。
3 讨论DNA聚合酶B是一种修复基因,主要独立修复短补丁 DNA损伤,polβ的缺失和突变,表达异常将会导致其功能丧 失和下降,引起基因组遗传的不稳定性〔5〕。文献〔6, 7〕报道,在 胃癌组织、宫颈癌、前列腺肿瘤细胞系发现了polβ基因热点 突变形式。Sr ivastava等〔8〕检测各种人肿瘤组织和细胞中po l B基因表达不同。本课题组的前期研究发现,食管癌组织细 胞中的polβ表达上调,polβ基因177~ 234区段58 bp 的大 片段缺失可能是食管癌中polβ的热点区域。小鼠NIH 3T3 细胞是从N IH Sw iss小鼠胚胎培养物中建立的细胞株,对 DNA转化及转染研究十分有用〔9〕,由于人和小鼠的polβ具 有很高的同源性,转染N IH 3T3细胞系后发现,转染后野生型 polβ的绿色荧光虽然在整个细胞都有但以细胞核内更明显, 而缺失突变型的polB则均匀的表达在整个细胞中,说明外 源的基因在细胞中也有表达,但表达的部位却不同。缺失突 变型的polβ却由于缺失了58bp,导致其中基因序列462位G y T导致117位出现终止码,使polβ翻译到117位氨基酸终 止,这种截短的蛋白表达异常,不能在细胞核中表达。通过转 染N IH 3T3细胞,发现其增殖速度增快,进入增殖期的细胞增 多,与突变型polβ对中国仓鼠细胞( CHO ) 的影响〔10〕一致。 由于小鼠和人的polβ具有很高的同源性,缺失突变型polβ 的碱基切除修复( BER) 功能降低,提示有可能使其发生恶性 转化,也揭示缺失突变型polβ有可能是食管癌发生的一个 重要因素,也为进一步研究其体内抗肿瘤治疗提供了基础依 据。
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