CCN 家族是近年发现的一组分泌性糖蛋白,包括半胱氨酸富集蛋白61( cy ste ine- rich 61,Cyr61)、结缔组织生长因子 ( connectiv e tissue g row th fac to r,CTGF)、肾母细胞瘤过度表达基因( nephrob la stom a o ver- expre ssed g ene,NOV )、W nt- 1 诱导信号通路蛋白W ISP- 1、2、3(W nt- 1,induced secre ted pro tein 1、2、3) 。由于CTGF、C y r61 和NOV 是这个家族最初的成员,因此,称为CCN 家族。它们由343~ 381个氨基酸残基构成4个结构模块,均含有38 个保守的半胱氨酸,具有广泛的生物学特性,影响细胞的生长、分化、粘附和运动,在妊娠、发育和分化、血管生成、伤口修复、炎性作用、肿瘤生长等多种生物学过程中起重要作用^〔1〕。研究发现,在不同的肿瘤中,CTGF、C yr61的表达水平及功能均不同^〔2〕。2005年9 月 - 2007年4月,本研究运用实时定量PCR 和免疫组化染色法对186例食管癌患者的食管癌组织和癌旁正常组织中的 CTGF、C y r61表达水平进行检测,并进行Log istic 回归分析,以探讨CTGF、Cyr61在食管癌和正常癌旁食管组织的表达,并分析其与食管癌相关危险因素的关系,为食管癌的预防及诊治提供参考依据。

选取2005- 2006年河南省林州市肿瘤医院手术切除的食管癌标本。食管癌原发灶及其相匹配的正常食管组织标本共186对。肿瘤标本和匹配的正常组织标本均通过病理组织学诊断。标本离体后15 m in内放在液氮罐中,后转移到- 80℃ 冰箱中冷冻保存。收集患者的性别、年龄、吸烟、淋巴结转移、家族史、肿瘤位置、浸润深度、肿瘤大小、病理分级以及病理类型等方面的临床资料。186例患者中男性116 例,女性70例。年龄31~ 80岁,平均年龄5814岁,其中有吸烟史98例,平均吸烟时间71 8年。有肿瘤家族史者73例。 恶性肿瘤国际临床病期分类( TNM 分期) T₁N₁M ₁ ~ T₃N₃M₃。 病理分级Ⅰ 级60人,Ⅱ 级53 人,Ⅲ 级73人。病理类型髓质型81例,溃疡型86例,蕈伞型19例。

荧光定量PCR 系统(美国B io- Rad 公司); Tr izo l试剂( 美国Inv itrogen 公司); AMV逆转录系统( 美国Prom ega 公司); 荧光定量PCR试剂盒(德国Roche 公司); 兔抗人Cyr61; 羊抗人CTGF; 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG (美国Chem icon 公司)。

用Tr izo l法从食管癌标本中提取完整的RNA,按试剂盒说明书进行操作。通过1%的琼脂糖凝胶电泳及RNA 的吸光度( A ) 值评估RNA 含量和纯度。在紫外光下可见18 和28 s RNA 条带。用50 LL 的 SuPerscr iPt II试剂将2 Lg的RNA逆转录成cDNA。

( 1)实时荧光定量PCR: 将转录的cDNA 1: 20稀释后作为PCR模板,反应体积为15 LL,将cDNA 作为模板进行PCR扩增。测定Ct值(实时荧光定量PCR 的理论基础是参数循环阈值( Ct),是指产生的荧光量超过一个固定的阈值时的循环次数) 。( 2)免疫组化染色法: 取食管癌组织和癌旁正常食管组织,严格按照试剂盒说明书进行操作。制作 16 Lm 厚的切片。进行免疫织化( SP) 染色。

运用spss1210 软件进行配对t检验、多因素log istic回归分析。α= 0. 05。

表 1

表 1 不同组织中CTGF、Cyr61基因mRNA和蛋白表达(x± s)

表 1 不同组织中CTGF、Cyr61基因mRNA和蛋白表达(x± s)

与正常食管组织比较,CTGF、Cyr61 mRNA 分别在74% ( 137 /186 ),63% ( 113 /186) 食管癌组织中表达上调。食管癌组织中CTGF、 Cyr61基因mRNA 及蛋白表达水平均明显高于配对的正常食管组织。

表 2

表 2 食管癌中CTGF、Cyr61 mRNA表达与各因素关系

表 2 食管癌中CTGF、Cyr61 mRNA表达与各因素关系

将各因素引入非条件Log istic回归模型进行多因素分析。结果表明,在食管癌中吸烟、浸润深度均为CTGF mRNA表达的危险因素。而淋巴结转移、肿瘤大小、浸润深度为Cyr61 mRNA 表达的危险因素。

表 3

表 3 食管癌中CTGF、Cyr61蛋白表达水平与各因素关系

表 3 食管癌中CTGF、Cyr61蛋白表达水平与各因素关系

将各因素引入非条件Log istic回归模型进行多因素分析。结果表明,吸烟、淋巴结转移、家族史、肿瘤大小、病理分级为食管癌中CTGF蛋白表达的危险因素。而Cyr61蛋白表达的危险因素为淋巴结转移、病理分级、浸润深度。

CTGF、Cyr61在人类肿瘤的发生过程中可能起着重要的作用,在不同肿瘤中所起的作用也不完全相同。有研究发现,CTGF在前列腺癌、脑瘤和乳腺癌组织中高表达^{〔3, 4, 5〕},Cyr61 在卵巢癌、子宫内膜癌中高表达^{〔6, 7〕}。有研究表明,CTGF、 Cyr61在多种肿瘤中高表达,可能具有加速癌细胞的增长,促进肿瘤形成的作用^〔8〕,与本研究结果相似。本研究结果显示,与正常食管组织比较,CTGF、Cyr61 mRNA 均在食管癌组织中表达上调,其蛋白表达水平也明显高于癌旁正常食管组织,提示CTGF、Cyr61在食管癌组织中高表达,对食管癌癌变起重要作用。多因素Log istic回归分析结果显示,浸润深度、 淋巴结转移、肿瘤大小和病理分级与食管癌中CTGF、Cyr61 表达相关,提示CTGF、Cyr61在食管癌的进展过程中,可能有促进癌细胞生长和转移,抑制细胞分化的作用,与最近的CTGF 、Cyr61在食管癌中参与调控细胞增殖和肿瘤转移的研究结果相一致^〔9〕。同时,本研究结果再次证实了吸烟及家族史等相关危险因素增加食管癌的危险性^〔10〕,可为食管癌的早期诊断及预防提供参考依据。

综上所述,CTGF、Cyr61在食管癌中可能促进肿瘤的发生发展,其表达的蛋白产物可作为干预治疗的重要靶蛋白。