研究表明,无机砷的甲基化不完全是一个解毒过程。砷甲基化过程的中间产物比无机砷具有更强的活性和毒性^〔1〕。砷导致个体间损伤不同可能是由于个体间砷有毒代谢产物的保留和分布不同造成的^〔2〕。也有研究表明,遗传差异也是造成个体间易感性不同的一个重要因素^〔3〕。无机砷((iAs)通过复杂的甲基化过程可代谢为一甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)、三甲基胂酸(TMA)等产物。为此,本研究采用实时荧光定量RT-PCR技术和原子荧光AFS-9130形态分析,SAP-10观察人外周血淋巴细胞中谷胱甘肽-S-转移酶(GSTO1)mRNA的表达与尿砷MMA%,DMA%,一甲基化指数(PMI)和二甲基化指数(SMI)之间的关系,探讨GSTO1与无机砷在体内甲基化的关系,为砷中毒的防治策略提供理论依据。

砷中毒病区选择新疆生产建设兵团农七师123团作为调查地区(饮水砷浓度>0.05mg/L)。从自愿参与调查的对象中选择中重度砷中毒患者6例,平均年龄(59.8±5.0)岁;轻度患者6例,平均年龄(57.7±4.5)岁;病区对照6人,平均年龄(55.0±4.4)岁;砷中毒重、中、轻度诊断按《地方性砷中毒诊断标准》^〔4〕进行诊断。非病区对照6人,平均年龄(58.3±4.5)岁。每组男女性各3人。病区与非病区具有相近的生活饮食习惯。全部调查对象均为汉族,均签署书面知情同意书。

尿样采集前3 d 通知被调查 对象禁食海产品,用聚丙烯塑料瓶采集空腹晨尿20 mL。用 肝素抗凝真空采血管采集静脉血5 mL。样品采集后于-80 ℃ 冷冻保存。

尿样自然解冻,超声混匀,按文献^〔5〕 方法采用AFS-9130检测仪( 北京吉天仪器公司)进行测量尿 总砷( TAs)。

尿样自然解冻,超声混匀,以12 000 r/m in离心10m in,取上清液,经01 22 Lm 水系膜过滤,滤液经 超纯水稀释后按文献^〔5〕方法,采用离子色谱氢化物发生原 子荧光法( IC-HG-AFS)测定,应用AFS-9130原子荧光光度计 和SAP-10形态分析仪( 北京吉天仪器公司) 测定尿iA s^Ⅲ,iASs^V,MMA,DMA 含量。各指标^〔6〕的计算方法如下: iAs = iA s^Ⅲ + iA s^V; MMA% = MMA /TAs; DMA% = DMA /TAs; 一甲基 化指数( PM I) = (MMA + DMA) /TAs; 二甲基指数( SM I) = DMA / (MMA + DMA )。

采用淋巴细胞分离 液对血液进行离心分层析出淋巴细胞后交大连宝生物公司检 测GST1 mRNA 相对表达量。主要步骤为: ( 1) 运用标准Trizo-l酚-氯仿一步法提取总RNA 并进行纯化。( 2) 对提取的 RNA 样品进行电泳确认后转录获得cDNA 。反应体系为: 5 × Prime Script^TM Buffer 2μL; Prime Script^TM RT Enzym eM ix 10.5 μL; Oligo dT Primer ( 50 μmol) 0.5 μL; Random 6 m ers ( 100 μmo l) 0.5 LL; Tota lRNA 1 μL; RNase Free H²O 5.5 μL; 反应 条件: 37 ℃ 15 m in,85 ℃ 5 s。( 3) 采用SYBR Green I荧光染 料嵌合法实时定量PCR 检测,管家基因B-action 引物B-action-F5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3',B-action-R: 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTACAAGCA-3'; 目的基因GSTO1 的引物 GSTO1-F: 5'-CCTGGTTTGAACGGCTGGA-3'; GSTO1-R: 5'-GGCCTCAGGGCTGTTCTGTAAG-3'。以反转录获得的cDNA 作为标准品,用EASY Dilution 分别按10 倍梯度稀释( 10⁰,10¹,10²,10³,10⁴ 倍)和5倍梯度稀释( 5⁰,5¹,5²,5³,5⁴,5⁵ 倍) 作为模板,分别制作管家基因B-ac tion和GSTO1的标准曲线,将RNA分别在B-action和GSTO1标准曲线上定量,并进行相 对表达量分析。PCR 反应体系[SYBR Prem ix D im erEraser ( 2 × conc. )]12.5 μL; Pr ime r F /R (各10 μm o l) 0.5 μL; RT 产 物2 μL; dH₂O 10 μL。反应条件: 95 ℃ 10 s,1个循环; 95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,45个循环。基因相对表达数值为 目的片段与内参片段的循环域( C t值)比值。

采用SPSS 1510 统计软件进行多组秩和检 验K ruska-lW allis test和Pearson相关分析。

表 1

表 1 不同人群尿砷形态与砷甲基化水平( 6例)

表 1 不同人群尿砷形态与砷甲基化水平( 6例)

分析可见,中重度组,轻度 组,病区对照组人群尿iAs,MMA,DMA,TAs水平均明显高于 非病区对照组人群水平。中重度组、轻度组人群PM I水平明 显高于非病区对照组人群水平,而中重度组和病区对照组人 群SM I水平明显低于非病区对照组人群水平。

表 2

表 2 GSTO1mRNA 在不同人群外周血淋巴细胞中的表达比较( 6例)

表 2 GSTO1mRNA 在不同人群外周血淋巴细胞中的表达比较( 6例)

经实验从外周血淋巴 细胞中提取的RNA 中扩增出B-ac tion和GSTO1 曲线。由表 2可见,中重度组、轻度组、病区对照人群的GSTO1 mRNA 表 达水平明显高于非病区对照组人群水平(P < 01 05),而且中 重度组人群GSTO1 mRNA 表达水平明显高于病区对照组人 群水平(P < 01 05)。

经分析,GSTO1 mRNA 表达与MMA % ( r= 0.206,P = 0.112)、DMA % ( r= 0.098,P = 0.700),PM I( P = 0.127,P = 0. 615 )和SM I( r = 0.192,P = 0.445)无相关性。

无机砷进入人体后代谢为多种砷化物,最终从尿液排出体外。MMA%和PMI反应了iAs代谢为MMA的第1次甲基化水平,DMA%和SMI反应了MMA代谢为DMA的第2次甲基化水平。本研究发现,砷中毒病区中重度组、轻度组、病区对照组人群PMI水平明显高于非病区对照组人群,而SMI水平明显低于非病区对照组人群,提示砷暴露人群的一甲基化水平高于非暴露人群,但MMA进一步甲基化为DMA的水平降低。

GSTO1通过mRNA转录已被证实在人体许多组织中表达^〔7〕,其编码一种能还原五价砷化物的酶^〔8〕。本研究表明,砷中毒病区中重度组、轻度组、病区对照组人群GSTO1mRNA表达水平明显高于非病区对照组,说明砷暴露可能促使机体GSTO1mRNA高表达,从而促进五价砷化物被还原为三价砷化物。GSTO1mRNA与MMA%、DMA%、PMI、SMI均无明显相关性,说明GSTO1mRNA表达与砷甲基化关系不明显。

近年研究表明,无机砷甲基化并不完全是一个解毒过程^{〔9, 10〕},其代谢过程的中间产物尤其是MMAÊ的细胞毒性高于无机砷^{〔11, 12〕}。本研究结果表明,人群慢性砷中毒引起的损伤很可能与慢性砷暴露引起人群甲基化水平增高,同时引起GSTO1mRNA表达增高,将五价砷还原为三价砷化物增多有关。