目前,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)对抗生素的 耐药性是影响幽门螺杆菌感染根治效果的主要原因,尤其对 甲硝唑、克拉霉素和阿莫西林的耐药率逐年增加。因此,Hp 耐药菌株的研究己引起人们普遍关注^〔1〕。为了解胃溃疡及 胃炎患者幽门螺杆菌(H p) 对甲硝唑等抗生素的耐药情况,指导临床用药,克服耐药菌株的产生,提高根治率,本研究于 2006-2008年选择广西右江民族医学院附属医院就诊的胃 溃疡及胃炎患者,从其胃黏膜中分离培养Hp,并进行耐药性 观察。结果报告如下。

(1)菌株来源:选择2006-2008年在右江民族医学院附属医院就诊并经病理诊断为胃溃疡、胃炎患者共482例,利用胃镜活检钳采集患者胃窦部黏膜,进行Hp培养,菌株经尿素酶实验、过氧化氢酶实验和Hp快速诊断实验进行鉴定。(2)培养基与试剂:哥伦比亚血琼脂培养基、脑心浸液培养基、螺杆菌添加剂(广州迪景微生物科技有限公司);酪蛋白绵羊血(本实验室自制);1%盐酸二甲基对苯二胺溶液、1%A-萘酚-乙醇溶液、3%过氧化氢溶液;幽门螺杆菌快速尿素酶试纸;甲硝唑(5μg/片)、阿莫西林(10μg/片)、克拉霉素(15μg/片)药敏纸片(杭州天和微生物试剂有限公司);微需氧袋(含5%氧的小型厌氧产气袋、厌氧塑料袋、厌氧塑料袋封口夹、厌氧指示剂)(广州迪景微生物科技有限公司);HpJ99标准菌株(中国幽门螺杆菌保藏中心赠送)。

将采集的胃窦部黏膜先利用H p快速尿素 酶实验进行筛选,阳性者则收集保存于脑心浸液培养基中,把 培养基置保温瓶中冷冻送回实验室。在无菌工作台上把采集 的胃黏膜和脑心浸液倒置在配制好的哥伦比亚血琼脂培养基 中,使用手术剪刀快速把黏膜组织剪碎,然后使用L棒在哥伦 比亚血琼脂培养基表面把黏膜碎粒涂布均匀,迅速放入厌氧 塑料袋,剪开小型厌氧产气袋,放入厌氧指示剂,最后使用厌 氧塑料袋封口夹封闭厌氧塑料袋,放置35℃ 培养7 d^〔2〕。

对分离培养出来的菌落进行革兰染色,染色方法按文献^〔3〕,经过染色镜检发现革兰阴性杆菌或革兰阴性弧菌即初步判断为H p。

对初步判断为Hp 的细菌进行氧化酶试 验、触酶试验、快速尿素酶试验^〔4〕。3个试验结果均为阳性^〔5〕 即鉴定该细菌为H p

采用纸片扩散法( K-B 法),观察 H p对甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素的耐药率。称取哥伦比亚 血琼脂培养基38 g,加入1 000 mL蒸馏水,制备血琼脂平板,按每个平皿(直径9 mm ) 25 mL进行分装。将孵育4 d 的H p 接种生理盐水试管中,校正浓度至0. 5麦氏浊度(相当于1. 0 ×10⁷ CFU /mL)。用无菌棉签拭蘸取菌液,在试管内壁旋转 挤去多余菌液后,在哥伦比亚血琼脂表面均匀涂布接种3次,每次旋转平板60度,最后沿平板内缘涂抹1周。在室温下平 板干燥3 ~ 5 m in后,用无菌镊子将药敏纸片紧贴于琼脂表 面,放入微需氧袋,置35 e 孵育3~ 4 d,测量抑菌环大小,记 录抑菌圈直径。抑菌环直径> 10 mm 判定为敏感,直径为0 时判定为耐药; 使用Hp J99标准菌株作为对照。

应用SPSS 13. 10软件进行χ² 检验及精确概率法分析。

536例胃溃疡及胃炎患者中,共分离培养 H p 374株,分离率为77. 59%。其中胃溃疡患者256例,分离 H p 201株,分离率为78. 52%; 胃炎患者226例,分离173株,分离率为76. 55%。

表 1

表 1 2006- 2008年374株Hp对3种抗生素耐药率(% )

表 1 2006- 2008年374株Hp对3种抗生素耐药率(% )

其中对甲硝唑耐药300株,耐药率为80.2%;对阿莫西林耐药57株,耐药率为15.2%;对克拉霉素耐药82株,耐药率为21.9%。表 1可见,Hp对3种抗生素的耐药率呈逐年上升趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.3Hp耐多药率比较(表 2)374株Hp中,对甲硝唑与克拉霉素同时耐药50株,耐药率为13.37%;对甲硝唑与阿莫西林同时耐药29株,耐药率为7.75%;对甲硝唑、克拉霉素和阿莫西林3种抗生素同时耐药14株,耐药率为3.74%。表 2可见,Hp对多种抗生素的耐药率呈逐年上升趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。

表 2

表 2 2006- 2008年Hp耐多药率比较(% )

表 2 2006- 2008年Hp耐多药率比较(% )

Hp的感染率及耐药率在不同国家或地区不尽相同^{〔6, 7〕},发达国家的耐药率要比发展中国家低,但Hp耐药率均在不断升高^〔8〕。本研究结果显示,从胃溃疡及胃炎患者中分离的Hp对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林均有一定耐药性,而且耐药率高于我国的平均水平^〔9〕,并且连续3年呈上升趋势。原因是近年来随着甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林在本地区的广泛使用,敏感细菌被逐渐消灭,耐药菌留下来并进行繁殖,数量上由劣势变成了优势;另一个原因是耐药遗传信息的传递产生新的耐药株。

研究还发现,Hp菌株同时对多种抗生素耐药。胡伏莲1102建议,当甲硝唑耐药率≥40%,克拉霉素≥15%~20%则不宜再使用甲硝唑或克拉霉素。本研究结果显示,胃病患者中分离的Hp菌株对甲硝唑和克拉霉素的耐药率均超出了这个范围。因此在对Hp感染患者的治疗中应该使用其他抗生素代替甲硝唑和克拉霉素,并且应建立Hp耐药性检测制度,根据耐药性选择敏感药物治疗,提高Hp治愈率,并加强Hp耐药机制的研究。