中国公共卫生  2010, Vol. 26 Issue (1): 57-59   PDF    
引用本文
余晓丹, 颜崇淮, 余晓刚, 沈晓明. 生长期缺锌对大鼠海马Egr家族基因表达影响[J]. 中国公共卫生, 2010, 26(1): 57-59.
YU Xiao-dan, YAN Chong-huai, YU Xiao-gang. Effect of zinc deficiency on expression of Egr gene in hippocampus of growing rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2010, 26(1): 57-59.
生长期缺锌对大鼠海马Egr家族基因表达影响
余晓丹, 颜崇淮, 余晓刚, 沈晓明    
上海交通大学医学院附属新华医院上海市儿科医学研究所上海市环境与儿童健康重点实验室, 上海200092
收稿日期: 2009-07-08.
基金项目: 国家自然科学基金(30600496);上海市重点实验室(06DZ22024);上海市儿科学重点学科(T0204);上海市医学重点学科(05Ⅲ002)资助项目
作者简介: 余晓丹(1971- ),女,福建人,副主任医师,博士,研究方向:儿童营养.
摘要: 目的 研究锌缺乏对生长期大鼠海马Egr家族(Egr1、Egr2、Egr3、Egr4)基因表达的影响,探讨缺锌影响学习记忆的基因转录调节机制。方法 选取刚出生的Sprague-Dawley大鼠3窝,每窝1只母鼠、10只仔鼠,3窝母鼠与仔鼠体重相近,仔鼠雌雄各半;随机分为3组:缺锌组(ZD)、配饲组(PF)、对照组(ZA),实验期60d;用实时荧光定量PCR检测大鼠海马Egr家族(Egr1、Egr2、Egr3、Egr4)mRNA的表达。结果 大鼠海马Egr1、Egr3、Egr4基因表达在3组大鼠间差异有统计学意义(F值分别为13.631,24.435,21.825,),ZD组(2.44×10-3,8.72×10-3,1.88×10-2)表达量低于PF组(3.13×10-3,1.60×10-2,2.68×10-2)、ZA组(3.96×10-3,1.92×10-2,3.53×10-2),且PF组低于ZA组;海马Egr2基因表达在各组间差异无统计学意义。结论 缺锌使海马锌指蛋白Egr1、Egr3、Egr4基因表达下调,是影响海马学习记忆的机制之一。
关键词: 锌缺乏     Egr基因     基因表达    
Effect of zinc deficiency on expression of Egr gene in hippocampus of growing rats
YU Xiao-dan, YAN Chong-huai, YU Xiao-gang, et al    
Shanghai Institute of Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092, China
Abstract: Objective To study the effect of zinc deficiency on the expression of Egr gene in hippocampus of rats.Methods Thirty newborn SD rats and their mothers were randomly divided in to three groups:zinc adequation(ZA),zinc deficiency(ZD),paired-fed(PF).After 60 days feeding,the RNA in hippocampus was extracted and the levels of Egr1,Egr2,Egr3,Egr4 mRNA were measured with real tmie fluorescent quantity PCR.Results The Egr1,Egr3,Egr4 gene expressions in hippocampus among the three groups were diffe rent signif icantly(F=13.631,24.435,21.825,P<0.05).The Egr1,Egr3,Egr4 gene expressions in hippocampus of ZD group were lower than that of PF group.While the Egr1,Egr3,Egr4 gene expressions in hippocampus of PF group were lower than that of ZA group.However,there was nodifference of the Egr2 expression in hippocam pus among three groups.Conclusion Downregulation of Egr1,Egr3,Egr4 mRNA expression in hippocampus by zinc deficiency is one of the mechanism of zinc deficiency affecting the learning and memory.
Key words: zinc deficiency     Egr gene     gene expression    

近年来,随着社会对小儿智力和心理行为的重视,有关营 养与智力关系的研究受到关注。研究表明,缺锌可引起学习 记忆障碍〔1, 2, 3〕。缺锌发生越早,对学习记忆功能的危害就越 大〔4〕。有关锌缺乏导致行为异常的机制目前尚不清楚。由 锌离子结合的锌指蛋白参与了50% 的真核生物的基因转 录〔5〕。作为即刻早期基因家族成员的Eg r基因是锌指蛋白,与海马学习记忆功能密切相关。本研究通过建立出生后长期 缺锌动物模型,研究锌缺乏对海马Eg r 家族( Eg r 1、Eg r 2、 Eg r 3、Egr 4)基因表达的影响,探讨缺锌影响学习记忆的基因 转录调节机制。

1 材料与方法 1.1 饲料与配方

饲料参照美国营养协会( A IN) 报告的 A IN-76配方162配制而成,正常饲料实测含锌291 5 μg /g; 缺 锌饲料实测含锌014 μg /g。

1.2 动物分组与饲养

刚出生的Sprague-Dawley大鼠(中科院上海动物所)3窝,每窝1只母鼠、10只仔鼠,3窝母鼠与仔鼠体重相近,仔鼠雌雄各半。随机分为3组:对照组(Zincadequate,ZA),缺锌组(ZincdefiCiency,ZD),配饲组(palredfed,PF)。21d断奶后每只仔鼠单笼饲养于不锈钢笼具。(ZA)组自由食用正常饲料;(ZD)组自由食用缺锌饲料;(PF)组食用正常饲料,但进食量限制为缺锌组大鼠前1d的进食量。每日清晨称大鼠体重并记录前1d的进食量,观察有无厌食、腹泻、皮炎、生长迟缓等缺锌症状。实验期60d。动物房洁净无尘,照明控制12h明暗交替。对照组及配饲组自由进食饮用水,缺锌组自由饮用去离子水。根据以下3个指标判断评价大鼠缺锌模型是否成功,即血清锌值、体重增长、饲料效价(每消耗1g饲料所增长的体重)。

1.3 实验方法 1.3.1 锌检测及海马取样

实验结束时,用5 m g /100 g 戊巴 比妥麻醉,行开胸术,由左心房穿刺取血3 mL,离心后取血清 测定血清锌。血清用双蒸水稀释,饲料用浓硝酸处理后,用电 感耦合等离子质谱议( ICP-MS)检测血清和饲料锌浓度; 处死 实验大鼠,剖开颅骨取海马,放置液氮中保存。所有手术器械 均用011%焦碳酸二乙酯( DEPC )浸泡12 h,高温高压消毒。

1.3.2 RNA 抽提及cDNA 合成

取约50 m g海马组织,据上 海生工生物公司RNA 抽提试剂盒来抽提组织RNA; 据华美 生物工程公司cDNA逆转录试剂盒,逆转录成cDNA。

1.3.3 引物设计

根据Genebank 上B-actin、Egr1、Egr2、 Egr3、Egr4的序列,利用01 igo 411软件设计5对特异性引物,每条引物各跨一个内含子: B-actin,上游引物5'CCTCTATGCCAACACAGTGC3',下游引物; 5' GTACTCCTGCTTGCTGATCC3'; Eg r1,上游引物; 5'GGCTCCTCTACCTACCCGTCTC 3',下游引物; 5'CCATTTCTTCCCTCCTGTCCT 3'; Egr2,上游引 物; 5'GCAAACACTACCGCCCTTCT 3',下游引物; 5'TCTCA-GAGCAACTGGCATCG 3'; Egr3,上游引物; 5'AAGGCTGTGACCGGCGTTTC 3',下游引物; 5'CGTGCGGATGTGAGTAGTGAGG 3'; Egr4,上游引物; 5'GCCTTCCCTGCCTCTTCCA 3',下游引物; 5'AAGGTATCGCCTGCTCTGTGG 3'。

1.3.4 实时荧光定量RT-PCR 扩增mRNA

用Roche L ight Cycler RNA M aste r SYBR G reen Ñ ( K it fo r one - step RTPCR) 试剂盒,在RocheL ight Cyc le Instrum ent上扩增。每个样 本重复2次。每次扩增都设阴性对照,以检验是否存在PCE 污染。

1.3.5 产物鉴定

PCR产物经2% 琼脂糖胶电泳分析,鉴定 所扩增的产物是否符合设计的片段长度,B-ac tin、Eg r1、Egr2、 Egr3、Egr4扩增产物长度分别为211,267,286,140,191 bp。

1.4 统计分析

采用SPSS 13. 0 软件进行分析。每个样品 的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为此样品此基因 校正后的相对含量。在整个实验中样本的靶序列的量来自于 标准曲线,最终必须除以参照物(对照组)的量。

2 结 果 2.1 缺锌对大鼠一般状况的影响

ZD组大鼠喂一段时间后 即出现食欲减退,精神萎糜,活动减少,并出现不同程度的腹 泻、口周皮炎、糙毛、毛发稀疏、干枯、无光泽、生长迟缓等缺锌 症状,随着喂养时间的延长,上述症状加重。

2.2 缺锌对大鼠摄食量、体重及血清锌水平的影响(表 1)
表 1 不同组别大鼠血清锌水平、体重及饲料效价比较(…x±s)

ZD组饲以缺锌饲料后第3d即出现食欲减退,饲料摄入量逐 渐下降; ZD组大鼠体重增长缓慢,从实验第4 d就明显落后 于ZA和PF组,至实验结束,ZD组大鼠体重增长、饲料效料 及血清锌浓度均明显低于PF和ZA组( P < 0101) 。

2.3 实时荧光定量PCR产物分析(图 1)
注: 1: 正常1; 2: 正常2; 3: 正常3; 4: 配饲1; 5: 配饲2; 6: 配饲3; 7: 缺锌1; 8: 缺锌2; 9: 缺锌3; M: m ark er。 图 1 实时荧光定量PCR 产物beta-actin的mRNA 表达

扩增产物2%琼脂糖 电泳,紫外线下扫描分析,B-actin长度为211 bp,Egr1、2长度在 250~ 300 bp,Egr3、4长度在150~ 200 bp,符合设计片段长度。

2.4 EgrmRNA 扩增基因量( 表 2)
表 2 不同组别Egr1-4 mRNA扩增基因量

ZD组大鼠海马除Egr2 表达未下调,其他3种亚型Egr 1,3,4基因均下调。

3 讨 论

海马长时程突触增强效应( LTP) 目前被公认为学习记 忆的突触可塑性模式,动物的学习记忆能力的优劣与其海马 区LTP呈明显正相关。目前研究与LTP相关的锌指基因主 要有Egr基因家庭4种成员Eg r-1(也称为ZIF268、NGFI-A 或 K rox24),Egr-2,Egr-3 和Egr-4。M alkan i等162检查了恐惧性 条件反射对Egr基因家族4种成员表达的影响,结果发现,训 练后15~ 30 m in仅Eg r-1 在外侧杏仁核背外侧部分明显增 加,24 h后恢复正常,其余成分在海马和皮层均未见增加,提 示在这种反射的学习过程中Egr-1在杏仁核的外侧核团中发 挥作用。学者发现,Egr-2,Egr-3,Egr-4与LTP有关17-82。锌 有3种不同的生物学功能-催化、结构和调节的功能。蛋白 质的锌指基序代表一种非常重要的结构作用,从锌指蛋白中 除去锌能引起锌指转录因子的功能损失,并细胞体外研究中 得到证实192。目前缺锌影响学习记忆己明确,但其机制尚不 清楚。缺锌大鼠是否通过改变海马中锌指蛋白Egr 基因表 达,使海马LTP的诱导与维持下降,导致学习记忆功能下降。 本研究发现,缺锌使海马锌指蛋白Egr1,3,4基因表达下调,导致LTP依赖的基因与新蛋白质的合成障碍,从而影响了 LTP的形成。但本研究未发现缺锌使Egr 2下降,有待于进一 步研究。

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