类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)与系统性红斑狼疮(systematic lupus erythematosus, SLE)是病因不明的自身免疫性疾病, 认为与环境、免疫、多基因遗传等因素有关, 至今仍无有效的治疗方法。国外研究发现^〔1-3〕, 蛋白酪氨酸磷酸酶N22(Protein Tyrosine Phosphatase 22, PTPN22)基因是RA及S L E的易感基因, 其单核苷酸多态性(Single-nucleotid poly-morphism, SNP) 1858 C/T被认为是RA及SLE的易感位点, 但对不同种族、不同地域人群的研究结果并不完全一致。为了解贵州省汉族人群RA及SLE与PTPN22基因1858C/T多态性的相关性, 本研究选取2005-2006年贵阳医学院附属医院部分确诊病例和健康体检者进行了观察。现将结果报告如下。

(1) RA病例组:选取贵阳医学院附属医院2005 -2006年住院及门诊确诊的RA病例110例, 其中女性75例, 男性35例, 均为汉族, 年龄16~76岁, 平均33.2岁; 诊断均符合美国风湿协会(ACR) 1987年诊断标准^〔4〕。(2) SLE病例组:选取贵阳医学院附属医院2005-2006年住院及门诊确诊的SLE病例98例, 其中女性70例, 男性28例, 均为汉族, 年龄15~76岁, 平均33.8岁, 诊断均符合美国风湿协会系统性红斑狼疮1982年诊断标准^〔4〕。(3) 正常对照组:在贵阳医学院附属医院门诊健康体检者中随机选取120人, 其中女性80人, 男性40人, 均为汉族, 年龄18~62岁, 平均33岁。

抽取调查对象外周血2 mL, -20 ℃冰冻保存, 基因组DNA提取采用酚-氯仿抽提法, 其A_260/A₂₈₀为1.6~1.8, 使用时DNA终浓度为100~300 ng/μL。

(1) PCR扩增:以基因组为模板, 扩增包含PTPN22 1858C/T位点的片段。引物序列^〔5〕:上游引物5′-TCA CCA GCT TCC TCA ACC ACA-3′, 下游引物5′-GAT AAT GTT GCT TCA ACG GAA TTT A-3′, 扩增片段为215 bp; 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。反应体系为25 μL, 含10 ×PCR buffer 2.5 μL, 2.5 mmol dNTP 2.0 μL, 10 pmol/μL引物各1.5 μL, 二甲基亚砜(DMSO) 1.2 μL, 模板2 μL,Taq酶0.5 μL (1.25U), 总体积25 μL。循环参数: 94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35次循环; 72 ℃延伸2 min。以上反应均在梯度扩增仪(英国TECHNE公司)上完成, PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳, BIO-RAD凝胶成像扫描仪上观察结果。(2) 限制性片段长度多态性分析:用限制性内切酶Xcm Ⅰ(美国NEB公司; 识别位点5′CCANNNNN′NNNNTGG 3′)消化PCR产物; 反应体系: PCR产物3.5 μL, 10 ×缓冲液(NEB)2 μL, Xcm Ⅰ 0.6 μL, 加水至20 μL, 混合后瞬时离心, 37 ℃孵育14~16 h。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、银染色观察其多态性, 若为1858C, PCR产物不能被Xcm Ⅰ切割; 若1858C突变为T, 则提供1个Xcm Ⅰ切割位点, 215 bp的PCR产物则被Xcm Ⅰ切割成169和46 bp。

图 1

注：1：50 bp Ladder Maker；2~9：阳性扩增产物条带(215 bp)。 图 1 PTPN22基因PCR产物的电泳结果

包含1858C/T多态位点的PTPN22基因的PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳, 在200~250 bp间约215 b p处可见一明显条带, 与理论预期相符。

图 2

注：1~12：CC型；13:50 bp ladder Mark。 图 2 Xem Ⅰ酶切PTPN22基因扩增产物的电泳结果

215 bp DNA扩增产物为CC型，不能被切割；可切割为169与46 bp的酶切产物为TT型；可切割为215，169与46 bp 3个产物的为CT型。

110例RA病例、98例SLE病例与120名正常对照者的PTPN22 1858C/T基因型均为CC型, 1858C等位基因频率均为100%。

Matthias Pierer等^〔5〕研究发现, PTPN22基因的错义单核苷酸多态性1858C/T与RA及SLE等自身免疫性疾病遗传性相关, RA与PTPN22的T等位基因的携带有关, 并且疾病的程度、类风湿因子(Rheumatoid factor, RF)状况与抗环瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide, CCP)抗体的状况与T等位基因的携带也有关系。美国、澳大利亚、法国、英国^〔6-9〕等国家也相继报道了PTPN22基因突变与RA及SLE等自身免疫性疾病相关, 均指出PTPN22是一种RA及SLE的易感基因, 但对不同种族、不同地域人群的研究结果并不完全一致, 说明这种遗传相关性与种族差异有关。IkariK等^〔10〕研究发现, 日本正常人群与RA人群中均未发现1858C/T多态性, 他认为PTPN22基因多态性仅与部分种族群体相关。本研究对贵州省人群RA及SLE的PTPN22基因1858C/T多态性观察结果显示, RA患者组及SLE患者组与正常对照组中均未发现1858T突变基因, 与Ikari的研究结果一致, 提示PTPN22基因1858C/T多态性与贵州省汉族人群RA及SLE可能无相关性。但有条件时应进一步扩大病例和地区的研究。