中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (12): 1517-1518   PDF    
引用本文
贺庆芝, 许雪梅, 孙杰. 甲醛对小鼠源性巨噬细胞DNA损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(12): 1517-1518.
HE Qing-zhi, XU Xue-mei, SUN Jie Damage effect of formaldehyde on DNA of RAW264.7 cell[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(12): 1517-1518.
甲醛对小鼠源性巨噬细胞DNA损伤作用
贺庆芝, 许雪梅, 孙杰     
南华大学药学与生命科学学院生物科学系细胞生物学教研室, 湖南 衡阳 421001
收稿日期: 2009-06-17
基金项目: 湖南省卫生厅基金(B2006105)
作者简介: 贺庆芝(1976-), 女, 湖南安仁人, 讲师, 硕士, 主要从事遗传毒理学研究。
摘要: 目的 探讨甲醛对小鼠源性巨噬细胞(RAW264.7细胞) DNA的损伤作用. 方法 用0, 20, 40, 80, 160, 320μmol/L甲醛处理RAW264.7细胞1 h.采用单细胞凝胶电泳技术检测甲醛对RAW264.7细胞DNA的损伤作用. 结果 甲醛剂量为20, 40, 80, 160μmol/L时, RAW264.7细胞DNA的迁移率和尾长分别为33.0%, 49.7%, 82.3%, 38.3%和11.2, 22.6, 30.1, 18.9μm, 与空白对照组4.3%和9.7μm比较, 差异有统计学意义(P < 0.05);当甲醛浓度达320μmol/L时, 细胞DNA的迁移率和尾长分别为6.3%和9.3μm, 与对照组比较, 差异无统计学意义(P > 0.05). 结论 低浓度甲醛可造成RAW264.7细胞DNA的损伤.
关键词： 甲醛     DNA损伤     RAW264.7细胞    
Damage effect of formaldehyde on DNA of RAW264.7 cell
HE Qing-zhi, XU Xue-mei, SUN Jie     
Branch of Cell Biology, Department of Life Science, School of Pharmacy and Life Science, Nanhua University Hengyang 421001, China
Abstract: Objective To explore damage effect of forma ldehyde on DNA of RAW 264.7 cell. Methods Single cell gele lectro phoresis was used for detecting the damagee ffect of forma ldehyde on DNA of RAW 264.7 cel.l The RAW 264.7 cell were exposed to 0, 20, 40, 80, 160, and 320 mol/L of formal dehyde for 1hr, respectively. Results It was shown that comet incidence and migration length of DNA of RAW 264.7 cells were increased remarkably in 20, 40, 80, 160 mol/L group.But the cometinc idence and migration length of DNA in 40 mol/L group (49.7%, 22.6±18.5 m) were more serious than 160 mol/L group (38.3%.18.9±17.5 m).There was no differrence in comet incidence and migration length between 320 mol/L group and control group. Conclusion The formaldehyde has damage effect on DNA of RAW 264.7 cell.
Key words: formaldehyde     DNA damage     RAW 264.7 cell    

甲醛是室内装修污染物的主要来源, 也是一种生物内源性有机化合物。因其来源广、毒性大、污染水平高、污染时间长等特点, 已成为当前环境监测的主要指标。动物实验表明, 甲醛具有很强的免疫毒性和致癌作用, 国际癌症研究所已将其列为人类致癌物质〔1〕。巨噬细胞是体内的一种主要免疫细胞, 具有吞噬和清除外来异物、病毒、细菌、突变细胞等作用, 从而保护机体健康。RAW264.7细胞是一种鼠源单核细胞源性巨噬细胞, 本实验将此细胞用不同浓度的甲醛进行染毒处理, 检测其DNA的损伤情况, 评价甲醛的遗传毒性。

1 材料与方法 1.1 试剂和仪器

RAW264.7细胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心); PRIM 1640培养基(美国GIBCO公司); 胎牛血清(杭州四季清公司); 胰蛋白酶(美国Hyclone公司); 10%甲醛溶液、低熔点琼脂糖、正常熔点琼脂糖, 溴化乙锭(美国Sigma公司); 十二烷基肌氨酸钠(华美生物工程公司); 其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱(美国Shill公司); 超净工作台(苏州安泰空气有限公司); DYY2 Ⅲ型电泳仪槽、DYY 211B型电泳仪(北京六一仪器厂); 1×70型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 细胞培养及分组处理

用含10%胎牛血清的PRIM 1640培养液调细胞密度至1×105个/mL, 37℃, 5%CO2条件培养。取对数生长期细胞, 用0.25%的胰酶消化, 1000 r/min离心5 min, 用磷酸盐缓冲液(PBS)制备单细胞悬液并调整细胞密度为105~106个/mL, 胎盼蓝法计数细胞活力。细胞活力应>95%。分装于7支2.0mL的离心管中, 其中6支依次加入甲醛, 终浓度分别为空白对照组, 20, 40, 80, 160和320μmol/L, 同时设H2O2阳性对照组。将细胞放于37℃培养箱内培养1h。

1.3 单细胞凝胶电泳

于载玻片上加第1层180 μL 1%的正常熔点琼脂糖, 待其凝固后, 37℃放置4h, 然后铺上第2层75 μL 1.0%的低熔点琼脂糖; 凝胶固化后铺第3层1.0%的低熔点琼脂糖50μL和细胞悬液30μL。参考文献〔2〕方法, 进行单细胞凝胶电泳(25V, 300mA, 20min)。取出载玻片浸入0.4mol/L Tris缓冲液(pH7.5), 中和30min, 用溴化乙锭(20mg/L)染色5min。24h内用荧光显微镜观察拍照。用CASP彗星分析软件分析彗星图片, 每个处理组共观察300个细胞。根据DNA含量将DNA损伤程度分为5级〔3〕。

1.4 统计分析

采用SPSS 11.0软件进行方差分析和χ2检验。

2 结果 2.1 RAW 264.7细胞DNA损伤彗星图(图 1)
注: A:对照组; B: 80 μmol/L甲醛组; C: 160 μmol/L甲醛组。 图 1 甲醛对RAW 264.7细胞DNA的损伤彗星图像

空白对照组细胞核DNA集中, 呈圆形, 无拖尾; 80μmol/L甲醛组细胞核DNA分散, 形成很长的彗星尾, 160μmol/L甲醛组细胞核DNA有拖尾, 但是大部分核物质比较集中, 彗星尾没有80μmol/L甲醛组明显。

2.2 液态甲醛对RAW264.7细胞的损伤分级(表 1)
表 1 甲醛对RAW 264.7细胞DNA损伤的影响

空白对照组细胞DNA的迁移率和尾长分别为4.3%和(9.7±4.3)μm; 当甲醛浓度为20, 40, 80, 160μmol/L时, 细胞DNA的迁移率和尾长分别为33.0%, 49.7%, 82.3%, 38.3%和(11.2±8.9), (22.6±18.5), (30.1±21.3), (18.9±17.5)μm。在一定范围内, 随甲醛浓度升高细胞DNA迁移率和尾长逐渐增加(P < 0.05)。

3 讨论

甲醛对DNA损伤作用已被证实〔4-6〕。本实验表明, 甲醛对RAW 264.7细胞DNA具有遗传性损伤作用, 在一定范围内, 随着甲醛浓度的增高, DNA的拖尾率和彗星尾长逐渐增高, 呈现明显的剂量-反应关系。当甲醛达到80μmol/L时, 拖尾率和尾长达到最高值, 表明DNA的断裂程度达到最高。但是当甲醛浓度达到160μmol/L或更高时, 随着甲醛浓度的增高, 其拖尾率和尾长反而下降; 当甲醛浓度达到320μmol/L时, 其拖尾率和尾长与对照组比较, 差异无统计学意义, 表明此时甲醛可能对细胞DNA的损伤已不再以断裂为主, 而主要引起细胞DNA发生交联, 由于交联的作用使核DNA泳出受阻, 而在核内集聚, 不呈现彗星现象〔7〕。在较低剂量下, 甲醛能所引起RAW 264.7细胞DNA损伤, 且存在明显的剂量-效应关系, 此时的损伤是以DNA链断裂为主, 而在高剂量作用下, 甲醛对RAW 264.7细胞的损伤可能是以DNA-DNA或DNA-蛋白交联为主。

参考文献
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