肺炎链球菌(Streptococcus pneum oniae)是引起人类肺炎、脑膜炎及败血症的最常见病原菌.近年来, 肺炎链球菌对青霉素、红霉素等常用抗生素的耐药率逐年增高, 导致经验用药失败, 给抗感染治疗带来困难^〔1〕.为了解肺炎链球菌的耐药表型及红霉素耐药相关基因, 本研究对2006-2007年分离自郑州大学第五附属医院就诊患者的87株肺炎链球菌株进行了药物敏感试验, 并进行红霉素耐药相关基因核糖体甲基化酶基因(ermB)及主动外排转运基因(mefA)检测.结果报告如下.

1 材料与方法 1.1 材料

(1)菌株:收集2006年1月-2007年12月郑州大学第五附属医院就诊患者的痰液、咽拭子、血液、脑脊液等标本中肺炎链球菌分离株87株; 质控菌株:肺炎链球菌ATCC49619。(2)试剂:奥普托欣(Optochin, OP)、四环素、氯霉素、左氧氟沙星、万古霉素、复方新诺明及红霉素等药物纸片(英国OXIOD公司); DNA ladder、dNTP、Taq酶(美国Promage公司); TriPure DNA提取试剂盒(瑞士Roche公司)。(3)仪器:VITEK-32全自动微生物分析仪、革兰阳性菌(GPI)卡(法国生物梅里埃公司)。

1.2 方法 1.2.1 肺炎链球菌鉴定与药敏

采集患者标本, 1h内接种于5%绵羊血平板, 置5%CO₂培养箱内孵育l8~24h, 根据菌落特点、镜下形态, 奥普托欣敏感试验初筛, 采用全自动微生物分析仪和GPI卡鉴定肺炎链球菌。药敏试剂采用K-B法。结果判断参照文献〔2〕。

1.2.2 红霉素耐药相关基因检测

(1) DNA模板制备:挑取平皿上过夜孵育的细菌, 利用Tri Pure总RNA提取试剂提取分离菌株DNA, 按产品说明书进行操作。(2) ermB、mefA基因引物序列^〔3〕:ermB-f:5′-GAAAAGGTACTCAACCAAATA-3′, ermB-r:5′-AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC-3′, 产物长度为639bp; mefA-f:5′-AGTATCATTAATCACTAGTGC-3′, mefA-r:5′-TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG-3′, 产物长度为348bp。(3) PCR扩增:反应体系50μL, 包括5μL模板DNA、5mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTP、0.4μmol/L引物和1.5 UTaq酶。循环条件为95 ℃ 4 min热变性后, 94 ℃ 1 min, 56 ℃ 2 min, 72 ℃ 2 min, 30个循环, 再延伸72℃ 10 min。取5μL PCR反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳, 在凝胶成像系统中观察结果。

2 结果 2.1 肺炎链球菌对常用抗生素耐药率比较(表 1)

表 1可见, 肺炎链球菌临床分离株对红霉素、复方新诺明、四环素、克林霉素、青霉素等抗生素均有较高的耐药率(中介率+耐药率); 万古霉素、左氧氟沙星对肺炎链球菌仍有较好抗菌活性。

2.2 红霉素耐药基因型分布(表 2)

在87株肺炎链球菌中, 检出红霉素耐药株76株(耐药+中介)。总检出率为94.7%;对红霉素敏感的11株肺炎链球菌均未检出ermB、mefA基因。

3 讨论

在过去10年中, 对大环内酯类抗生素耐药的肺炎链球菌已蔓延全球, 其基因型与表型具有明显的地区差异^〔4-5〕。亚洲病原微生物耐药监测网(ANSORP)监测数据显示^〔6〕, 中国大陆地区的红霉素不敏感率高达74.8%, 中国香港地区的红霉素不敏感率高达76.8%。本研究结果显示, 本院肺炎链球菌临床分离株的红霉素不敏感率为87.4%, 对其他几种常用抗生素的耐药率也较高, 应予以重视。

肺炎链球菌对红霉素的耐药机制主要有2种, 1种是耐药基因ermB编码的23 SrRNA甲基化酶导致的核糖体靶位甲基化, 另1种是mefA编码的主动外排系统^〔7〕。近年来, 一些新的耐药机制不断被发现, 如细菌L22和L4核糖体蛋白的突变、23 SrRNAⅤ区和Ⅱ区的基因突变^〔8〕; 研究表明, 不同地区流行的大环内酯类耐药肺炎链球菌的耐药机制有明显差异^{〔6, 9-10〕}。本研究对肺炎链球菌检测结果显示, 所有红霉素耐药株中, 94.7%耐药株检出ermB和/或mefA, 其中以单独检出ermB阳性株为主(71.0%), 其次是ermB和mefA同时阳性株(17.1%), 单独检出mefA阳性株(6.6%), 与上述报道基本一致, 提示本地区肺炎链球菌对红霉素的耐药机制是ermB基因和/或mefA基因同时或单独介导耐药, 其中以ermB基因为主。此外, 有4株红霉素耐药的肺炎链球菌未检出ermB和mefA基因, 提示可能存在其他耐药机制, 有待进一步研究。