沙门菌是引起食源性感染的常见致病菌^〔1〕，常规检测方法有分离培养、生化鉴定、血清学试验等。由于沙门菌有2 000多种血清型，因而监测工作多繁琐、费时、费力。实时荧光定量PCR检测技术是近年来的新方法，已经愈来愈多地用于病原体诊断^〔2〕。研究表明，沙门菌侵袭基因invA高度保守，几乎存在于沙门菌所有血清型中，其编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白，决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力，与其致病性显著相关^〔3〕。根据这一特点，为探讨快速、敏感、稳定的沙门菌检测方法，本研究应用沙门菌侵袭基因invA设计引物和探针序列，建立沙门菌荧光定量检测方法并研制沙门菌检测试剂盒。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株

(1)沙门菌标准菌株:包括伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌等；(2)分离株:从食品样品、患者粪便分离的沙门菌分离株及非沙门菌株，共50株；(3)非沙门菌标准株:包括大肠埃希菌、枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌，福氏志贺菌、奇异变形杆菌、溶血性链球菌、白色念珠菌等(均为广州市疾病预防控制中心保存菌株)。

1.1.2 仪器试剂

ABI Fast7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Real Time PCR TaqMan酶(大连宝生生物工程有限公司)。

1.2 方法 1.2.1 菌株培养及DNA模板提取

将菌株接种于普通肉汤液体培养基培养18~24 h进行复苏，然后转种至选择性SS培养基培养18~24 h。在平板上挑取2~3个单个菌落，与100 μL灭菌纯水研磨混匀，95 ℃加热10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为DNA模板。

1.2.2 引物及探针设计与合成

根据沙门菌侵袭基因invA序列(基因登录号GenBank No.EU348369)，运用分子生物学软件ABI Primer express 3.0设计引物和探针，探针的荧光标记选择荧光物质(F AM)作为报告发光基团，淬灭物(TAMRA)为淬灭基团。上游引物序列为:5′-CGGAACGCGCTT-GATGA-3′(1441~1457)，下游引物序列为:5′-GGTCGAGCATATGTTTTGTTTCCt-3′(1517~1540)，探针序列为:5′-FAM-CGCTGGCGCGCAACGTCA-TAMRA-3′(1481~1498)，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 荧光定量

PCR扩增体系优化及反应条件在荧光定量PCR反应体系中，对Mg²⁺浓度、探针浓度、引物浓度及其酶浓度进行优化，获得优化反应体系为:25 μL反应体系中，10×buffer 2.5 μL，20 mmol/L dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl₂ 3 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，热启动酶(Hotstart-Taq) 2.5 U (1 μL)，10 μmol/L探针1 μL，模板DNA 2 μL，补加灭菌双蒸水至25 μL。反应程序为: 94 ℃预变性1 min，然后94 ℃变性10 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。

1.2.4 建立定量标准曲线

将已知浓度的阳性样品进行10倍稀释得10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7浓度梯度，按上述反应体系和反应条件进行反应，得到标准曲线。判定标准曲线循环阈值(Ct值)及其与模板浓度的线性关系；循环阈值(Ct值)=16~30，表明可检出沙门菌株，超过这个范围均不能检出。

1.2.5 检测方法评价

(1)特异性:用沙门菌荧光定量PCR方法对非沙门菌进行检测，观察其特异性。(2)敏感性:用已知菌体数量的沙门菌按10倍稀释法进行稀释，然后再用荧光定量PCR检测，计算本方法的最低检测限，同时用普通PCR检测作对照。(3)稳定性:将荧光定量PCR检测试剂混合均匀分装并-20 ℃冷冻保存，然后每1个月取出进行检测，观察试剂稳定性。(4)重复性:用荧光定量PCR法对沙门菌进行重复多次检测，观察其重复性效果。

1.2.6 分离标本检测

用建立的沙门菌荧光定量PCR检测方法对本中心门诊体检的临床分离阳性标本和食物中毒标本共240份进行检测，与阳性对照样本和阴性对照样本进行比较，观察其检测效果，评价该试剂盒和方法的可靠性。

2 结果 2.1 标准动力扩增曲线和定量标准曲线

动力扩增曲线图结果显示，循环阈值(Ct)16.334 5，19.395 9，23.189 2，26.686 6，29.254 4，30.773 1，31.334 1和32.000 0，分别对应阳性样品10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7浓度梯度和阴性对照。当浓度稀释到10-7以上时，Ct值 > 31.334 1，与阴性对照接近，表明这一浓度下已不能检出沙门菌。定量标准曲线图结果显示，不同梯度定量模板数的对数值与Ct值之间呈良好线性关系，有极好的相关关系，相关系数为0.99；模板数不同，其Ct值也不同，模板数愈少，Ct值愈大。

2.2 特异性

结果显示，所有沙门菌标准株的荧光定量PCR循环阈值(Ct)在16~30之间，表明目的菌株均可准确检出，而非沙门菌株循环阈值(Ct)在32~40之间，均不能检出，表明该检测方法特异性好。

2.3 敏感性

将已知菌体数量(3 ×10⁶)的阳性沙门菌按10倍稀释法进行稀释，然后用荧光定量PCR检测，判定最低检测限；同时用普通PCR检测作对照。结果表明，荧光定量PCR的敏感度比普通PCR高100倍以上。

2.4 重复性与稳定性

用本法对沙门菌和非沙门菌重复多次检测。结果显示，该检测方法重复性好。-20 ℃冷冻保存，每个月取出试剂进行荧光定量PCR检测，连续检测9个月，仍可获得结果，表明该试剂稳定，-20 ℃冷冻保存至少能保持9个月。

2.5 分离标本检测

对本中心分离的食物中毒标本和门诊健康从业人员体检分离标本240份进行检测。结果显示，所有沙门菌株荧光定量PCR循环阈值(Ct)在20~28之间，表明采用本方法可准确检测样品中的沙门菌，与沙门菌常规检测方法结果相一致。

3 讨论

研究表明，沙门菌体内高度保守序列invA基因决定了沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力，检测invA基因可以确认沙门菌的存在^〔3〕。荧光定量PCR技术融汇了PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，无需PCR后处理和冗长的电泳检测^〔2〕。本研究根据沙门菌保守invA基因筛选设计特异引物和探针序列，通过对实验条件的摸索优化，建立了沙门菌invA基因荧光PCR检测方法，经临床检测，与沙门菌常规方法及普通PCR检测结果一致，但灵敏度比普通PCR高100倍，并且有引物和探针双重保证，具有操作简单、灵敏度高，特异性、稳定性与重复性好的优点，可用于食物中毒、商检、出入境检验检疫等，具有广泛的应用前景。