糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病的主要并发症之一，是糖尿病引起失明的最主要病因。DR的主要治疗方法是控制血糖和视网膜光凝，但一些患者在经过上述治疗后，视网膜病变仍然继续进展。DR是一种慢性炎症性疾病，一氧化氮(NO)参与了糖尿病视网膜微血管损伤的病理过程^〔1〕。牛磺酸为小分子的含硫氨基酸，是视网膜中含量最丰富的游离氨基酸，具有调节渗透压、稳定细胞膜、抗氧化损伤等多种生理作用^〔2〕。研究发现，牛磺酸通过抑制核转录因子(NF-κB)的活化减少NO的释放，减轻炎症反应^〔3〕，对糖尿病具有潜在的治疗作用^〔4〕。本研究探讨牛磺酸对糖尿病视网膜组织中一氧化氮及其合酶(NOS)的影响，观察牛磺酸对糖尿病性视网膜病变的改变作用。

选用封闭群雄性SD大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心)24只，体重200~250 g。单笼喂养，自由进食饮水，自然昼夜光线照明。随机选取8只大鼠作为正常对照组，将造模成功的糖尿病大鼠16只随机分成2组即糖尿病组及牛磺酸干预组，分别饲以标准颗粒饲料及添加1.2%牛磺酸饲料。

Surestep血糖仪及试纸(美国强生公司)；Diastix^TM尿糖试纸(澳大利亚Bayer公司)，UV751GD紫外可见光光度计；Olympsu IX71型显微镜(日本Olympsu公司)。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)。NO测试盒、nNOS及iNOS免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物制品公司)。

动物注射药物前禁食12 h，自由饮水。用链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病，临用前用0.1 mmol/L (pH 4.5)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成1%的STZ溶液，按60 mg/(kg·bw)一次性腹腔注射STZ，注射后72 h取尾静脉血及尿液，采用葡萄糖氧化酸法测定血糖和尿糖。血糖浓度>16.7 mmol/L、尿糖在(+ + +)以上者即为模型建立成功。对照组腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液。

动物处死后立即摘除双侧眼球，一侧眼球测定视网膜NO含量，另一侧眼球进行视网膜组织化学染色。测定NO的眼球置入冰袋上，解剖显微镜下沿角膜缘后1 mm剪开眼球，弃去眼前节及玻璃体，分离视网膜神经上皮层，分析天平上称重后，用冰生理盐水制成10%的组织匀浆。采用硝酸还原学法用分光光度计测定视网膜组织匀浆中NO含量。

采用S-ABC眼球摘除后置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，常规切片脱蜡，3%过氧化氢孵育，热修复抗原，正常山羊血清封闭，分别加入nNOS或iNOS特异性抗体，4 ℃过夜，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，置温盒内37 ℃保温20 min，滴加免疫组化染色(SABC)试剂，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，二甲基氨基偶氢苯(DAB)显色，镜下观察，水洗中止反应，苏木素复染，脱水，透明，封片。阳性结果以胞浆及胞核内出现棕黄色或黄色颗粒为准。切片在Olympus IX71型显微镜下数码拍照，分别随机抽取各组视网膜组织切片3张，每张随机取5个高倍镜视野，医学图像分析系统Image-Pro Plus 6.0检测吸光度(A)值。

采用SPSS 15.0统计软件进行方差分析，最小显著差法(LSD)进行样本均数的两两比较。

表 1

表 1 各组视网膜NO含量检测结果(μmol/L)

表 1 各组视网膜NO含量检测结果(μmol/L)

糖尿病组视网膜NO含量明显高于对照组(P < 0.01)，而牛磺酸干预组视网膜NO含量低于糖尿病组(P < 0.01)。

表 2

表 2 各组视网膜nNOS及iNOSA值测量结果(x±s)

表 2 各组视网膜nNOS及iNOSA值测量结果(x±s)

nNOS阳性细胞在各组大鼠视网膜内均有分布，并集中于内核层和节细胞层，对照组阳性细胞较多。与对照组nNOS阳性细胞A值(0.461±0.037)比较，糖尿病组nNOS阳性细胞A值明显减少，其平均数为(0.125±0.024)，2组差异有统计学意义(P < 0.01)；而牛磺酸干预组nNOS阳性细胞A值(0.429±0.035)，无明显下降，高于糖尿病组(P < 0.01)。糖尿病组视网膜厚度变薄，内丛状层变化较明显。对照组大鼠内核层和节细胞层内iNOS阳性细胞很少，阳性细胞平均A值为(0.063±0.005)，而糖尿病组及牛磺酸干预组视网膜iNOS阳性细胞增加。糖尿病大鼠视网膜内iNOS阳性细胞A值为(0.390±0.022)，与对照组比较，明显升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。虽然牛磺酸干预组视网膜iNOS阳性细胞A值与对照组相比也增加，但其A值(0.101±0.006)要比糖尿病组的(0.390±0.022)低很多(P < 0.01)。

NO是一种重要的细胞间信号分子，由氧分子和L -精氨酸通过NOS催化产生。nNOS产生生理浓度的NO，调节细胞活力和维持血管功能，可减轻糖尿病引起的血管内皮和神经细胞损伤。iNOS在炎症症介质诱导下产生，释放大量NO，导致神经变性和细胞凋亡，引起严重的眼病^〔1〕。糖尿病是一种具有慢性炎症特征的疾病。nNOS阳性细胞在正常大鼠视网膜组织广泛存在，随着糖尿病病程的发展而减少；而iNOS阳性细胞在正常大鼠视网膜几乎不存在，患糖尿病后增多，nNOS与iNOS活性的变化对糖尿病视网膜的炎性损伤具有调控作用^〔5〕。本研究结果显示，12周糖尿病大鼠视网膜NO的含量增加，内核层和节细胞层内iNOS阳性细胞A值增加，nNOS阳性细胞A值减少，iNOS与nNOS共同作用使视网膜损伤变薄。

牛磺酸是脑、视网膜中含量很丰富的自由氨基酸，具有抗氧化、调控炎症反应等多种生理作用，可下调糖尿病大鼠视网膜中神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及mRNA的表达，减轻视网膜损伤^〔6〕。试验表明，牛磺酸对糖尿病具有治疗作用^〔7〕。牛磺酸通过抑制核转录因子NF-κB的活化，阻止iNOS的表达，从而减轻炎症反应^〔3〕。本研究发现，牛磺酸可以减少糖尿病视网膜一氧化氮的含量，阻止nNOS的下降，减少iNOS的表达，进而对视网膜具有保护作用。