糖尿病是新疆特高发疾病之一^〔1〕。李琳琳等^〔2〕研究显示, 钙蛋白酶10(CAPN-10)基因、脂联素(APMI)基因+45T > G和+276G > T位点单核苷酸多态性(SNPs)与新疆维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病(T2DM)具有相关性^〔3〕, 提示人体内脂质谱的异常可能是糖尿病患病的危险因素; 血浆中胆固醇酯转运蛋白(CETP)基因多态性和T2DM相关^〔4〕。为了探讨CETP基因TaqⅠ酶切多态性与维吾族T2DM及其体现人脂质谱的关系, 本研究检测了不同糖耐量水平维吾尔族人体内脂质谱, 同时采用聚合酶链反应-限制性内切酶第度多态性(PCR-RFLP)技术对CETP基因TaqⅠ酶切进行基因型鉴定, 分析比较不同糖耐量水平的体内脂质谱与CETP基因多态性的变化。结果报告如下。

选择新疆库尔勒地区轮台县维吾尔族居民为样本, 依据病例对照设计方法, 在筛查人群中设立正常糖耐量组、糖耐量异常组、2型糖尿病(T2DM)组3个组。正常糖耐量组106人, 其中男性50人, 女性56人, 平均年龄(52±9)岁; 糖耐量异常组53人, 其中男性25人, 女性28人, 平均年龄(53±9)岁; T2DM组53人, 其中男性25人, 女性28人, 平均年龄(53±9)岁。T2DM组与正常糖耐量对照组的性别年龄构成差异均无统计学意义。

调查对象禁食12 h后, 于次日上午8点, 采用问卷调查方式, 进行面对面询问。内容包括:人口基本特征(姓名、性别、年龄、出生日期)、居住地址、文化程度、职业、婚配情况、职务、工作性质、劳动强度、疾病史等基本情况; 同时测量血压、身高、体重、腰围、臀围; 统一空腹采集肘静脉血10 mL待检。

取5 mL血样, 分别采用气相色谱技术、全自动生化分析仪技术、酶法、免疫比浊法等检测空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。糖耐量异常筛查判断标准:正常糖耐量(UNGT):空腹血糖(FPG) < 5.6 mmol/L; 糖耐量异常(UIGT):5.6 mmol/L≤7.0 mmol/L; 2型糖尿病(TU2DM):FPG≥7. 0 mmol/L。体质指数(BMI)=体重/身高(kg/m²), BMI < 19者属于消瘦, 18~25之间为正常, 25~30之间为超重, > 30时属于肥胖。

取另外5 mL血样, 采用改良Miller法提取血液基因组DNA, 用紫外分光光度计进行纯度和定量测定后, 置于-80 ℃保存备用。参照文献合成引物^〔5〕, 上游引物为5′-CACTAGCCCAGAGA2GAGGAGTGCC-3′; 下游引物为5′-CTGAGCCCAGCCG2CACACTAAC-3′; 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系:10 ×缓冲液2 μL, dNTP (10 mmol/L)1 μL, 2 mmol/L MgCl₂溶液2 μL, Taq DNA聚合酶1.5 U, 引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板1 μL, 加ddH₂O补足25 μL。PCR反应循环参数为:95 ℃预变性4 min, 95 ℃变性30 s, 60 ℃复性30 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环, 72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭(EB)染色检测扩增结果。PCR扩增后产物用限制性内切酶TaqⅠ(立陶宛Fermentas公司)酶切, 65 ℃消化过夜, 消化产物1.2%琼脂糖凝胶电泳、EB染色后, 用Bio-Rad凝胶成像系统拍照并判断酶切结果。

SPSS 13.0软件进行分析。基因型和等位基因频率采用直接计数法统计, 以Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。计量资料均用x±s表示, 计数资料用χ²检验; 组间比较采用t检验和单因素方差分析, 危险因素采用Logistic回归分析。

表 1

表 1 T2DM组、糖耐量异常组及正常组基本情况比较(x±s)

表 1 T2DM组、糖耐量异常组及正常组基本情况比较(x±s)

表 1可见, 各组BMI、腰围、FPG和TG比较差异均有统计学意义, 表明3组人群的选择符合本研究的要求, BMI、腰围、FPG和TG与糖耐量异常关系密切。

图 1

注: marker: 100 bp DNA标记物; 1, 4: H + H-; 2: H + H +; 3: H-H-。 图 1 CETP基因TaqⅠ酶切位点的PCR-RFLP检测结果

CETP基因TaqⅠ酶切位点PCR扩增片段大小为535 bp, 经TaqⅠ限制酶消化后出现3种基因型:变异型(H+H+):TT (361, 174 bp)、杂合型(H+H-): TC (535, 361, 174 bp)和野生型(H-H-):CC (535 bp)。

表 2

表 2 3组人群CETP基因TaqⅠ位点基因型频率比较(%)

表 2 3组人群CETP基因TaqⅠ位点基因型频率比较(%)

CETP基因TaqⅠ酶切位点基因型在总体样本2组中的分布符合Hardy-weinberg平衡。基因型频率差异有统计学意义(χ²=10.84, P=0.028)。表明该位点基因型在3组人群中的分布差异有统计学意义; 等位基因频率差异无统计学意义。

表 3

表 3 总体样本CETP基因TaqⅠ位点不同基因型与各变量比较(x±s)

表 3 总体样本CETP基因TaqⅠ位点不同基因型与各变量比较(x±s)

表 3可见, 3种基因型的空腹血糖(FPG)差异有统计学意义(P=0.001)。单独对T2DM组进行分析, 未发现基因型与体内脂质谱之间差异有统计学意义。

表 4

表 4 2型糖尿病与CETP基因TaqⅠ位点多态性多因素Logistic回归分析

表 4 2型糖尿病与CETP基因TaqⅠ位点多态性多因素Logistic回归分析

对T2DM组和正常组的基因型、BMI、体型、腰围和TG进行多因素Logistic回归分析, 表 4可见, TGCETP基因型和腰围是T2DM的独立危险因素(P < 0.01或P < 0.05)。

本研究表明, 正常组中H-H-、H+H+和H+H-等3种基因型频率分别为20.7%, 34.0%, 45.3%, 其中H+H-型最多, 其次是H+H+, H-H-最少。与相关文献^{〔5, 6〕}结果相近。T2DM组中H-H-、H+H+和H+H-的基因型频率分别为11.3%, 18.9%, 34.0%, 其中也是以H+H-型为主, 其次是H+H+, H-H-最少。有研究^〔7-8〕显示, T2DM组的基因型频率主要以H+H+居多。提示CETP基因在不同种族人群患T2DM的遗传变异可能具有人群异质性。

本研究结果还显示, CETP基因TaqⅠ酶切位点基因型频率在3组人群的分布差异有统计学意义, T2DM组的H+H-基因型频率明显高于其他组, 表明CETP基因TaqⅠ酶切位点基因多态性与新疆维吾尔族T2DM的发生可能密切相关。但对其等位基因型频率进行比较, 差异无统计学意义, 可能是CETP基因的变异主要与其基因型分布有关, 而与等位基因的频率分布相关性不大。

通过对CETP基因TaqⅠ位点多态性与包括体内脂质谱在内的多个变量进行比较, 均显示CETP基因不同基因型的空腹血糖(FPG)差异有统计学意义, 揭示CETP基因多态性与FPG具有相关性, 而与体质指数(BMI)、腰围、血压、血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)的差异无统计学意义, 揭示CETP基因TaqⅠ位点多态性与维吾尔族体内脂质谱不具有统计学相关性。多因素Logistic回归分析显示, T2DM的独立危险因素依次是TG、CETP基因型和腰围。H+H-基因型携带者患T2DM的危险性增加(OR=4.042, 95% CI=1.243~13.149)。其具体原因还需进一步研究。