目前, 国内对人体中的血钴含量测定尚无标准方法, 对于钴作业人员和正常人的血钴含量调查均需要建立检测方法。本实验采用石墨炉原子吸收法测定全血中的钴含量, 并应用于钴接触人员血钴的检测。此方法具有取样量少、用酸量少、稀释倍数少、成本少、适于大量样品的测定等特点。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)仪器:PE-800石墨炉原子吸收分光光度计(美国PE公司); 钴空心阴极灯, AED-01型自控电热消化器(北京博瑞赛公司)。(2)试剂:钴标准储备液:1000 mg/L (国家标准物质中心)。钴标准使用液:由标准储备液用1%硝酸溶液稀释成50 μg/L钴标准使用液。超纯水(华晶集团制造集成电路用水)。硝酸:MOS级(上海国药集团)。30%过氧化氢:MOS级(上海国药集团)。

1.2 实验步骤

(1)血液采集:将采血管放入30%硝酸溶液中浸泡过夜, 取出后用纯水冲洗数次, 晾干。加入0.1 mL 2%肝素钠水溶液, 置于75%真空干燥箱中烘干, 备用。抽取静脉血后封口, 混匀, 低温保存并尽快测定。(2)样品前处理:选用微量酸消化作为前处理方法。取1000 μL血样于5 mL刻度管中, 放入自控电热消化器中120℃加热约120 min至血样呈浅黑色。放冷后, 加入0.75 mL硝酸, 放入消化器中80℃加热45 min, 加入0.2 mL过氧化氢, 继续消化20 min。消化完成后, 升温至150℃赶酸, 近0.3 mL时加少量纯水, 重复2次, 冷却后定容至1 mL, 溶液应呈淡黄色, 同时取不含钴的牛血作为空白。(3)标准曲线制作:标准曲线范围0~10.0 μg/L。按步骤(2)消化5支不含钴的牛血, 赶酸后, 加入标准使用液配制成0, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 μg/L钴标准系列, 绘制标准曲线。(4)样品测定:将消化液转移至进样杯中, 由自动进样器加样20 μL, 测定其浓度。测得的结果减去空白后即为样品中钴的浓度。(5)仪器条件:波长240.7 nm; 狭缝0.2 L; 灯电流30mA; 高纯氩气; 计算方式:峰面积; 信号方式:背景校正(塞曼效应扣背景); 石墨管类型:原装热解平台石墨管, 进样20 μL。

2 结果 2.1 基体改进剂的选择

本实验中选用磷酸二氢铵、磷酸二氢铵+硝酸镁、磷酸氢二铵、硝酸镁、氯化钯、硝酸镁+硝酸钯混合溶液作为基体改进剂。经过对比, 20 g/L磷酸二氢铵作为基体改进剂效果最好。同时加入第二基体改进剂曲拉通100^〔1〕, 可以防止暴沸现象出现。

2.2 基体改进剂用量的选择

以20 g/L磷酸二氢铵作为第一基体改进剂, 选择2~10 μL比较第一基体改进剂的效果, 加入10 μL时重现性较好。所以磷酸二氢铵的用量选择10 μL。第二基体改进剂曲拉通100用量为6 μL。

2.3 灰化温度的选择

灰化温度选择1100~1500℃进行测定消化的血样, 灰化温度在1400℃时灵敏度较好, 且背景吸光度低, 可以有效去除干扰, 所以, 选择1400℃作为灰化温度。

2.4 原子化温度的选择

原子化温度选择2000~2400℃进行测定, 吸光度在2200℃后开始下降, 背景吸收2200℃后趋于平稳, 所以原子化温度选择2200℃。

2.5 工作曲线及检出限

对0.0~10.0 μg/L范围内钴的测定呈良好的线性关系, 标准曲线回归方程为y=0.0077x+ 0.0001, 相关系数为0.9995, 检出限为0.548 μg/L。

2.6 准确度与精密度实验

样品中分别增加2.0, 5.0 μg/L钴标准, 用本方法消解后平行测定8次, 回收率为96.89%~98.01%。相对标准偏差为7.11%~9.95%。

2.7 干扰实验

分别加入1 μg血液中常见的几种离子K、Na、Ca、mg、Mn、Fe、Zn、Cu、Cl-、PO₄^3-, 定容至1 mL (相当于1 mg/L), 经过测定, 二者测定值差异无统计学意义, 故血钴的测定不受这几种离子的影响。

3 讨论

全血中的钴含量由于受各种因素影响, 不同地区、不同方法所报的参考值范围不一, 使用石墨炉原子吸收法进行测量, 发现正常人的血中钴含量较低。据报道, 非职业接触钴的个体, 血液中钴的含量低于2 μg/L^〔2〕, 所以选择标准曲线范围0~10.0 μg/L。本实验比较了微波消解、微量酸消化、湿法消化、干灰化法和离心法^〔3〕前处理方法, 其中微波消解具有溶样时间短、耗能低、试剂用量少、污染轻、防止组分损失的特点, 但不适用于大量样品的测定, 可用于超标样品的复测; 干灰化法能耗率高, 样品容易污染, 回收率较低, 不适于血中钴的前处理; 离心法操作简单、污染少, 但对于钴的测定, 回收率不理想; 微量酸消化具有取样量少、用酸量少、稀释倍数少、成本少、适于大量样品测定等特点, 所以选用微量酸消化。需要注意的是, 5 mL试管刻度的准确性, 使用前应进行1 mL的校准, 或选用5 mL尖底刻度管时可以增加其精密度; 温度增加不宜太快, 防止由于受热不均而产生暴沸; 定容后有可能出现少量白色沉淀, 如果出现沉淀应以3000 r/ min进行离心。

综上所述, 该方法操作简单、背景干扰低、结果准确可信、成本低、易于普及, 可以为疾病诊断及健康检查提供科学依据。