中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (11): 1359-1360   PDF    
引用本文
曲花玲, 姜丽平, 于畅, 耿成燕, 仲来福, 陈敏, 刘晓芳. 3-氯-1, 2-丙二醇对人胚肾293细胞DNA损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(11): 1359-1360.
QU Hua-ling, JIANG Li-ping, YU Chang, et al. 3-monochloropropane-1, 2-diol induces oxidative DNA damage in HEK 293 cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(11): 1359-1360.
3-氯-1, 2-丙二醇对人胚肾293细胞DNA损伤作用
曲花玲1, 姜丽平2, 于畅3, 耿成燕2, 仲来福1, 陈敏1, 刘晓芳1     
1. 大连医科大学食品营养与安全系, 大连 116044;
2. 大连医科大学中日永和医药研究所;
3. 辽宁出入境检验检疫局
收稿日期: 2009-06-02
作者简介: 曲花玲(1982-)女, 山东烟台人, 硕士在读, 研究方向:食品营养与安全。
摘要: 目的 研究3-氯-1, 2-丙二醇(3-MCPD)对人胚肾293(HEK293)细胞DNA损伤作用。 方法 以HEK293细胞为靶细胞, 3-MCPD设5个剂量组:0, 1.25, 2.5, 5, 10 mmol/L, 应用单细胞凝胶电泳检测3-MCPD诱导的HEK293细胞DNA损伤; 将3-MCPD设4个剂量组:0, 2.5, 5, 10 mmol/L, 以2, 7-二氢二氯荧光素(DCFH)法测定HEK293细胞内活性氧(ROS)水平; 将3-MCPD设4个剂量组:0, 1.25, 2.5, 5 mmol/L, 通过免疫组化法测定8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)在HEK293细胞内的表达水平。 结果 与对照组比较, 1.25~10 mmol/L的染毒组细胞DNA链断裂, 细胞形成彗星样脱尾, 尾DNA%明显上升, 且呈剂量依赖关系(P < 0.05)。2.5~10 mmol/L的染毒组细胞内ROS水平表达升高, 在10 mmol/L时明显升高(P < 0.05)。1.25~5 mmol/L的染毒组细胞内8-OHdG表达水平上升, 在2.5和5 mmol/L时8-OHdG表达明显增强(P < 0.05)。 结论 3-MCPD导致了HEK293细胞DNA损伤, 可能是通过细胞内ROS升高及8-OHdG形成增加所造成的氧化性DNA损伤作用。
关键词： 3-氯-1, 2-丙二醇     HEK293细胞     DNA损伤     氧化应激    
3-monochloropropane-1, 2-diol induces oxidative DNA damage in HEK 293 cells
QU Hua-ling, JIANG Li-ping, YU Chang, et al     
Department of Food Nutrition and Safty, Dalian Medical University, Dalian 116044, China
Abstract: Objective The DNA damage induced by 3-monochloropropane-1, 2-diol (3-MCPD) and the underlying mechanisms were studied in HEK293 cells. Methods As target cells, HEK293 cells were treated at the concentrations of 0, 1.25, 2.5, 5, and 10 mM with 3-MCPD at 37℃ for 1 hr.The single cell gelelectrophoresis assay (SCGE) was applied for quantitative analysis of DNA damage which was caused by 3-MCPD.We also measured the level of intracellular ROS by use of the 2, 7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay when HEK293 cells were treated with different concentrations of 3-MCPD (0, 2.5, 5, and 10 mM) at 37℃ for 1 hr.The level of oxidative DNA damage was evaluated using immunope roxi-dases taining for 8-hydroxydeoxyguanosine (82OHdG) when HEK293 cells were treated with different concentrations of 3-MCPD (0, 1.25, 2.5, 5 mM) at 37℃ for 3 hr. Results The results showed that 3-MCPD at all tested concentrations (1.25-10 mM) caused a significant increase of DNA strand breaks in HEK293 cells.The numerical values for tail DNA% significantly increased compared to the control (P < 0.05).The level of intracelluar ROS was significantly increased when exposed to 10 mM of 3-MCPD (P < 0.05).The formation of 82OHdG was significantly increased at the concentration of 2.5-5 mM of 3-MCPD (P < 0.05). Conclusion 3-MCPD can induce DNA damage in HEK293 cells.The DNA damage is probably induced by the inc reased level of in tracellular ROS and formation of 8-OHdG, which cause oxidatively generated DNA damage and formation of DNAs trand breaks.
Key words: 3-monochloropropane-1     2-diol     HEK293 cells     DNA damage     oxidative stress    

3-氯-1, 2-丙二醇(3-monochloropropane-1, 2-di-ol, 3-MCPD)是食品污染物氯丙醇类化合物中最常见的代表物质, 它已经在许多食品和食品原料中被检测到, 主要存在于利用酸水解植物蛋白质加工而成的酱油、蚝油等调味品、方便食品以及某些保健食品中〔1〕, 而一些家庭自制的高温加工的谷类制品如面包、奶酪等在烘烤焙过程中氯丙醇污染水平也有升高〔2〕。研究表明, 3-MCPD是一种鼠类致癌物, 具有免疫毒性、生殖毒性、神经毒性, 体外试验显示具有致突变性〔3〕。本研究选用3-MCPD在较低剂量水平(≤10 mmol/L)时, 探讨3-MCPD致人胚肾293(HEK293)细胞DNA损伤及作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)细胞系:HEK293细胞ATCC CRL-1573(美国菌种保藏中心)。(2)主要试剂:3-MCPD, 无色似油状液体(美国Alfa Aesar公司), 纯度>98%。3-MCPD以三蒸水溶解, 贮存液浓度为1000 mmol/L, 4℃保存。临用时用培养液稀释至所需浓度。胎牛血清(DMEM)培养基、胎牛血清(美国GIBCOBRL公司); 低熔点琼脂糖(LMA)、正常熔点琼脂糖(NMA)(英国GibcoBRL公司); 二甲基亚砜(DMSO)、RNAseA、2′, 7′-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA) (美国Sigma公司); 抗8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)单克隆抗体(日本JaICA公司); UltraSensitiveTMS-P超敏试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司); 其他试剂均为分析纯。(3)主要仪器:CO2培养箱(美国FORMA公司); 3550型酶标仪(美国BIO-RAD公司); 28M型超速离心机(美国BECKMAN公司); MRX-152型冷冻高速离心机(日本TOMY公司); JY2002型电子天平、FA2004型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司); JM250型水平式电泳仪(大连捷迈公司); 650-60型荧光分光光度计(日本HITACHI公司); CK2型倒置显微镜、BX51型荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

(1)单细胞凝胶电泳(SCGE)试验:参照文献〔4〕。(2)细胞内活性氧(ROS)测定:参考文献〔5〕方法, 采用荧光探针DCFH-DA测定3-MCPD作用于HEK293细胞后产生的细胞内ROS。(3)细胞内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)免疫组化分析:参照文献〔6〕方法略加改动。显微镜下阅片, 应用Image-proplus4.5.1图像(A)分析系统进行定量图像分析, 观察50个随机选择的细胞, 用测得的吸光度值〔7〕(数值放大1000倍)表示8-OHdG阳性表达的相对强弱。

1.3 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行分析, 2组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果 2.1 -MCPD对HEK293细胞DNA的影响(表 1)
表 1 3-MCPD诱导对HEK293细胞DNA影响(x±s)

彗星试验(SCGE)结果显示, 1.25, 2.5, 5, 10 mmol/L的3-MCPD与HEK293细胞接触1 h后, HEK293细胞呈现彗星样拖尾, 随着剂量的增加, 拖尾现象更明显, 彗星样细胞的尾部DNA (%)明显大于对照组(P < 0.05), 且呈剂量依赖关系。

2.2 -MCPD对HEK293细胞内ROS水平的影响(图 1)
注：与对照组比较，*P < 0.05。 图 1 3-MCPD对HEK293细胞内ROS水平的影响

2.5~10 mmol/L 3-MCPD与HEK293细胞接触1 h后, 3-MCPD在2.5和5 mmol/L的浓度时, ROS生成量与对照组比较差异无统计学意义。随着3-MCPD浓度的增高, 细胞内ROS生成量增加, 3-MCPD浓度至10 mmol/L时, 细胞内ROS水平明显高于对照组(P < 0.05)

2.3 3-MCPD对HEK293细胞内8-OHdG表达水平的影响(图 2)
注：与对照组比较, P < 0.05。 图 2 3-MCPD对HEK293细胞内8-OHdG表达水平的影响

经免疫组化染色后, 在显微镜下观察, 8-OHdG阳性物质呈棕黄色, 主要集中在细胞核中, 细胞核的着色随3 -MCPD剂量的增高而加深, 经定量分析, HEK293细胞核的平均吸光度值, 在1.25 mmol/L 3-MCPD时无变化, 随着3-MCPD浓度的增大, HEK293细胞核的平均吸光度值增高, 在2.5和5 mmol/L时, HEK293细胞核的平均吸光度值与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。

3 讨论

SCGE试验是最近几年发展起来的一种灵敏且可靠的检测单个细胞核DNA损伤技术〔8〕。本研究采用此方法检测3 -MCPD对HEK293细胞的DNA损伤作用。结果表明, 1.25~10 mmol/L的3-MCPD可诱发HEK293细胞的DNA链断裂, 提示3-MCPD可导致HEK293细胞的DNA损伤。结果表明, 3-MCPD能引起细胞内ROS水平的上升, 而且在浓度为10 mmol/L时, HEK293细胞内ROS的生成量明显增加。随着3-MCPD剂量水平的上升, HEK293细胞内8-OhdG表达水平逐渐升高, 在2.5和5 mmol/L时细胞内8-OHdG表达水平明显升高。提示3-MCPD导致了ROS水平的升高, 并进一步造成HEK293细胞的氧化性损伤。

综上所述, 3-MCPD通过诱导HEK293细胞内ROS水平的升高, 产生氧化应激反应, 进一步造成氧化性DNA损伤, 表明3-MCPD对HEK293细胞的DNA损伤很有可能与氧化性DNA损伤机制有关。

参考文献
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