中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (11): 1354-1356   PDF    
引用本文
汪川, 余倩, 康睿, 张朝武, 裴晓方, 刘衡川. 金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法优化[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(11): 1354-1356.
WANG Chuan, YU Qian, KANG Rui, et al. Optimization of REP-PCR fingerprint map classification for Staphylococcus aureus[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(11): 1354-1356.
金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法优化
汪川, 余倩, 康睿, 张朝武, 裴晓方, 刘衡川     
四川大学华西公共卫生学院医检教研室, 成都 610041
收稿日期: 2009-03-04
基金项目: 四川大学华西公共卫生学院青年科学研究基金
作者简介: 汪川(1974-), 女, 四川成都人, 副教授, 博士, 研究方向:分子生物学技术在微生物检验中的应用。
通讯作者: 刘衡川
摘要: 目的 优化金黄色葡萄球菌细菌基因组重复序列PCR (REP-PCR)指纹图谱分型方法, 并在临床分离株分型研究中应用, 为构建金黄色葡萄球菌同源性追踪体系提供依据。 方法 试剂盒法提取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923基因组DNA作为模板, 根据参考文献设计REP引物, PCR扩增其基因组中靶序列。优化反应体系Mg2+浓度、模板量、引物浓度和退火温度, 以得到最佳指纹图谱。以优化好的REP-PCR方法对10株金黄色葡萄球菌临床分离株进行分型。 结果 PCR反应体系Mg2+浓度2.5 mmol/L, DNA模板量125 ng/25μL, 引物REP1R、REP2浓度各0.6μmol/L, 退火温度40℃时, 指纹图谱条带最清晰、明亮; 10株临床分离株指纹图谱均在0.5~1.0 kb之间出现1条相同条带, 其中1~3, 4, 5, 8, 9号菌株图谱相同; 7和10号菌株除在0.5~1.0 kb出现1条条带外, 还在1.0~1.5 kb出现1条条带, 在1.5~2.0 kb出现1条条带; 6号菌株共产生5条条带, 分别出现在0.5~1.0 kb (2条), 1.0~1.5 kb (2条)和1.5~2.0 kb (1条)。 结论 成功建立优化的金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法; 10株临床分离株用该法分为3型。
关键词： 金黄色葡萄球菌     REP-PCR     条件优化     指纹图谱分型    
Optimization of REP-PCR fingerprint map classification for Staphylococcus aureus
WANG Chuan, YU Qian, KANG Rui, et al     
Department of Medical Technology, West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract: Objective To optin ize reaction conditions of repetitive extragenic palindrom is PCR (REP-PCR) finger printmap classification for Staphylococcus aureus and to apply the method in the classification of S.aureus clinic isolates and supply data for S.aureus homology tracing. Methods Cenom is DNA of S.aureus reference strain ATCC 25923 was abstracted with bacteria DNA abstract kit and used as the template for PCR.Target sequences in S.aureus genom is DNA were amplified with thepriners designed according to the reference.To obtain optin umfinger print maps, template, Mg2+, and priner concentrations of the reaction system and annealing temperature of PCR were optin ized Then 10 clinic strains of S.aureus were classified by optinum PCR. Results The electrophoresis bands of amplified products were most clear when 25μL of the reaction system contained 125 ng template, 215 mmol/L Mg2+, 0.6μmol/L each primer, and primers were annealed at 40℃.Each fingerprint maps of tenstrains of clinic isolates showed a band between 0.5 kb to 1.0 kb.The fingerprint maps of number 1, 2, 3, 4, 5, 8, and 9 strain were same, and the maps of number 7 and 10 s train were also same.The fingerprint map of number 7 and 10 strain showed 3 bands, one in 5.0 kb-1.0 kb, one in 1.0-1.5 kb and one in 1.5-2.0 kb.The fingerprint map of number 6 strain showed 4 bands, of which two laid between 015 kb and 110 kb, one laid between 1.0 kb and 1.5 kb and one between 1.5 kb and 2.0 kb. Conclusion The optimum REP2PCR fingerprint map classification method of S.aureus was obtained and tenclinic strains of S.aureus were classified in to 3 types by the classification method.
Key words: Staphylococcus aureus     REP-PCR     condition optimization     fingerprint map classification    

金黄色葡萄球菌分型方法包括表型分型和基因分型2大类, 其中优化金黄色葡萄球菌细菌基因组重复序列PCR (REP -PCR)技术是一种比较新的细菌基因分型方法〔1〕, 与脉冲场凝胶电泳(PFGE)相比, 该法操作更简便, 无须特殊仪器试剂、成本低、扩增带不过于复杂, 分辨能力强, 更适合基层开展工作。REP-PCR反应体系和循环条件可能影响图谱清晰性, 故优化反应条件, 建立标准方法非常必要。本研究选择金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923为对象, 优化REP-PCR反应体系Mg2+浓度、模板量、引物浓度和退火温度, 建立了金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法, 并用该法对金黄色葡萄球菌临床分离株分型, 为构建金黄色葡萄球菌感染疾病的同源性追踪体系提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923, 金黄色葡萄球菌临床分离株(本室保藏)。REP引物〔2〕:REP1R-Ⅰ: 3′-CGGICTACIGCIGCIIII-5′; REP2-Ⅰ:5′-ICGICTTA TCIGGCCTAC-3′; 树脂型基因组DNA提取试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司); Taq DNA聚合酶、dNTPs、500 bp DNA Ladder (北京天根生化科技有限公司)。

1.2 方法 1.2.1 细菌基因组DNA提取与定量

用树脂型基因组DNA提取试剂盒提取金黄色葡萄球菌标准菌株基因组DNA。为保证破壁充分, 先将收集的新鲜菌体用溶菌酶(20 mg/mL)于37℃处理60 min, 再用蛋白酶K (20 mg/mL)于50℃处理2 h。将提取的DNA用BioSpec-mini紫外可见分光光度计(SHIMADZU CORPORATION, 日本)定量DNA浓度。

1.2.2 PCR扩增反应体系及循环参数

参照文献〔3〕初步确定反应体系各成分量:在25 μL反应体系中, 含MgCl2 2.0 mmol/L, dNTPs0.2 mmol/L, 引物REP1R-1和REP2-1各0.4 μmol/L, DNA模板100 ng, Taq DNA聚合酶2.5 U。按文献〔4〕初步设定循环参数:95℃, 4 min, 94℃ 1 min, 40℃ 1 min, 65℃ 3 min, 进行35个循环, 最后65℃延伸10 min。

1.3 条件优化试验

在不同Mg2+浓度(0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mmol/L)下进行PCR检测, 其他条件一致; 在不同引物浓度(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 μmol/L)下进行PCR检测, 其他条件一致; 在不同的DNA模板量(25, 50, 75, 100, 125 ng/25 μL)下进行PCR检测, 其他条件一致; 在不同退火温度(38, 40, 42℃)下进行PCR检测, 其他条件一致。PCR扩增结果经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后; 应用Touching1000B凝胶图像分析仪(上海天呈科技有限公司)观察DNA指纹图谱。

1.4 金黄色葡萄球菌临床分离株REP-PCR指纹图谱分析

按1.2.1提取基因组DNA并测定其浓度。根据优化实验确定的反应体系和循环参数进行PCR

2 结果 2.1 Mg2+浓度的优化(图 1)
注:M: 500 bp DNA Ladder; 1~5:Mg2+浓度2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5 mmol/L。 图 1 REP-PCRMg2+浓度优化电泳图谱

图 1可见, Mg2+浓度为2.5 mmol/L时电泳图谱较为明亮, 包括长约2.0 kb和长度在0.5~1.0 kb之间的2条稳定条带, 且条带形态整齐, 故选择Mg2+浓度为2.5 mmol/L为反应最优条件。

2.2 模板量的优化(图 2)
注：M：500 bp DNA Ladder；1-5：模板浓度125，100，75，5O，25 ng/25p~L。 图 2 REP-PCR模板浓度优化电泳图谱

图 2可见, DNA模板量为100、125 ng/25 μL时的电泳图谱均较为明亮, 包括长约2.0 kb和长度在0.5~1.0 kb之间的2条稳定条带。但DNA模板量为125 ng/25 μL时条带形态更整齐、明亮, 故选择DNA模板量为125 ng/25 μL为反应最优条件。

2.3 引物浓度的优化(图 3)
注：M：500 bp DNA Ladder；1-5：引物浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/L。 图 3 REP-PCR引物浓度优化电泳图谱

图 3可见, 引物浓度为0.6 μmol/L时的电泳图谱较为明亮, 且包括长约2.0 kb和长度在0.5~1.0 kb之间的2条稳定条带, 故选择0.6 μmol/L为最优引物浓度。

2.4 退火温度的优化

设置38, 40和42℃3个退火温度。优化结果可见, 退火温度为40℃时电泳图谱条带清晰、明亮、整齐, 并包括长约2.0 kb和长度在0.5~1.0 kb之间的2条稳定条带, 故选择40℃为最优退火温度。

2.5 金黄色葡萄球菌临床分离株REP-PCR指纹图谱分析(图 4)
注：M：500 bp DNA Ladder；1~1O：临床分离株1~10。 图 4 金葡菌临床分离株DNA REP-PCR电泳图谱

图 4可见, 所有菌株均在0.5~1.0 kb之间出现1条长度相同条带; 其中1~3, 4, 5, 8, 9号菌株图谱完全相同; 7号和10号菌株图谱相同, 除在0.5~1.0 kb有1条条带外, 还在1.0~1.5 kb有1条条带, 在1.5~2.0 kb有1条条带; 6号菌株共产生5条条带, 分别为0.5~1.0 kb 2条, 1.0~1.5 kb 2条和1.5~2.0 kb 1条。

3 讨论

重复DNA序列是20世纪90年代发现存在于原核生物基因组中的DNA片段, 主要为重复基因外回文序列(REP)和肠细菌重复基因基准序列(ERIC)。REP-PCR即以REP序列为引物, 对细菌基因组DNA进行PCR扩增, 可根据得到的电泳指纹图谱的差异, 对细菌进行分型或同源性检测。该法操作方便, 分辨效果好〔5〕。本研究以金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923为对象, 对REP-PCR反应体系Mg2+浓度、模板量、引物浓度和退火温度进行优化, 成功建立了金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法。结果表明, 在25 μL反应体系中, DNA模板量为125 ng, Mg2+浓度为2.5 mmol/L, REP1R、REP 2引物浓度分别为0.6 μmol/L, 退火温度为40℃时, 扩增产物的电泳图谱条带最清晰、明亮。其中Mg2+浓度与文献〔3〕相同, 退火温度与文献〔4〕一致, 模板量和引物浓度则与文献〔3〕有所不同。用本优化方法可将10株金葡菌临床分离株分为3型。与文献〔6〕比较, 使用另一种重复序列ERIC为引物的ERIC-PCR所得的指纹图谱与REP-PCR指纹图谱完全不同。前者扩增条带在0.25~2.5 kb之间, 可辨区带的数目为9~11条, 表明引物不同, 指纹图谱也不相同。本研究结果显示, 金黄色葡萄球菌标准株和临床分离株REP -PCR指纹图谱均在0.5~1.0 kb之间出现了1条长度相同条带, 该条带是否为金黄色葡萄球菌特征条带还需进一步研究。

参考文献
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