滴虫性阴道病是由阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis, TV)引起的人类生殖道常见非病毒性性传播疾病。据估计, 全球每年有1亿7千万感染者^〔1〕。甲硝唑是当前临床上常用于治疗滴虫性阴道病的药物, 近10年来, 滴虫对甲硝唑抗性明显上升^〔2〕, 加强甲硝唑抗药性监测对于指导临床用药有重要意义。核糖体DNA基因转录间隔区(rDNA-ITS)是存在于编码真核生物核糖体基因之间一段非转录区, 因其在进化上变异度较大, 已成为种内和属内间比较的一个理想靶标^〔3〕。为此, 本研究于2007年对甲硝唑敏感性不同的39株阴道毛滴虫rDNA-ITS区序列进行序列分析, 旨在探讨ITS区序列多态性与甲硝唑耐药表型的相关性, 为筛选新的分子标记用于临床监测耐药虫株提供基础依据。

于2006年8月-2008年1月采集贵阳市妇产医院、贵阳医学院附属医院妇产科门诊病人39株阴道毛滴虫虫株, 分别以消毒棉签取患者阴道后穹窿分泌物置入含抗生素(终浓度:青霉素200 U/mL, 链霉素200 U/mL)及10%小牛血清的肝浸汤培养基中, 37℃培养。48 h后传代, 共传代3次。取1 mL毛滴虫的混悬液接种到LB培养基(Luria-Bertani培养基), 37℃振荡培养24 h, 若未出现浑浊, 且取样镜检未见污染, 即证明该样品已达到纯培养, 可用于后续实验。

5330型PCR仪(美国eppendorf公司); 高效液相色谱(HPLC)级甲硝唑原粉(美国Sigma公司); Chelex-100(美国Bio-Rad公司); rTaq DNA聚合酶, DL2000 Marker (大连TaKaRa公司); PCR产物纯化试剂盒(北京博大泰克公司); PCR引物合成(上海生工公司); 其他生化试剂为国产分析纯。

采用96孔板法, 根据文献〔4〕方法稍作改进。待滴虫生长至对数生长期(约培养48h), 将约10⁴个滴虫依序加入含经倍比稀释的甲硝唑药液(0.39~400μg/mL)培养板中, 在需氧条件下37℃孵育48h。同时设无药孔为阴性对照。以镜下无活动滴虫为最低致死浓度(MLC)。MLC≥50 μg/mL, 即认为耐药虫株^〔4〕; 同等条件下3次重复。

采用chelex-100方法^〔5〕提取滴虫DNA。待滴虫生长致对数生长期时, 3500 g离心5min, 收集约1×10⁷/mL虫体到1.5 mL离心管中, 加入200 μL 5% Chelex-100和10 μL的20 mg/mL蛋白酶K, 振荡混匀, 55℃孵育45 min, 沸水浴中8~10 min, 冰浴2 min, 室温下12000 g离心3 min, 上清即为DNA。

根据Snipe LJ等^〔3〕的文献稍作改进。ITS特异引物:TVITSF:ACCGCCCGTCGCTC-CTACCGA, TVITSR:CTCCGCTTAATGAGATGCTTC。PCR总反应体系50 μL, 其中含有:1×PCR缓冲液, 2.5 mmol/L MgCl₂, 0.2 mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTPs), 1.25 Ur Taq DNA聚合酶, 引物TVITSF和TVITSR各为25 pmol/L, DNA模板为10~20 ng。扩增反应条件为:95℃ 10 min, 95℃ 15 s, 54℃ 20 s, 72℃ 30 s, 进行35个循环, 最后72℃ 5 min。PCR产物采用PCR产物纯化试剂盒直接纯化, 并送上海博亚生物公司测序。

采用DNA Star 5.0软件中的Meg Align软件进行分析, 寻找多态性位点。

表 1

表 1 临床分离株甲硝唑最小致死浓度(MLC)(μg/mL)和ITSC66T表型

表 1 临床分离株甲硝唑最小致死浓度(MLC)(μg/mL)和ITSC66T表型

39株虫株中, 甲硝唑敏感虫株20株, 耐药虫株19株。

阴道毛滴虫ITS区包括ITS1, ITS2。为获得完整的ITS区, 引物设计时在18S3′端和28S5′端。利用特异引物对滴虫基因组DNA进行PCR扩增。PCR结果示唯一条带, 在近400 bp处, 与目的条带在同一位置。故将其直接纯化并送测序。所获得的序列结果放入美国国立生物技术信息中心(NCBI)中进行blastn, 显示所扩增的序列与阴道毛滴虫ITS序列相似性达99%, 证明所获得序列是阴道毛滴虫ITS序列。去除18S3′端和28S5′端序列, 只剩ITS区和5.8 S共约285 bp。截取有效的ITS序列后, 用DNA Star 5.0软件中的Meg软件对所获得39条序列进行分析比对。39株虫株ITS2序列和5.8S序列完全相同, ITS1仅在18, 38, 42, 43, 54, 57, 65和T6等8个虫株发现1个点突变, 即C66T突变。余虫株序列完全相同。

39株滴虫中, 共有8株具有C66T突变, 阳性率为20.5%。20株敏感虫株中, 6株具C66T突变; 19株耐药虫株, 2株具C66T突变。经Fisher确切概率法检验, 提示甲硝唑耐药性与rDNA-ITS区C66T突变差异无统计学意义(χ²=0.108, P > 0.05)。

Snipes LJ等^〔3〕对109株阴道毛滴虫rDNA-ITS序列分析发现, 有15%的阴道毛滴虫虫株在位点66有一个C变成T的突变, 余核苷酸无变化; 且C66T点突变株对甲硝唑的MLCs明显高于非突变株, 故认为该点突变与甲硝唑耐药性有关。Xiao JC等^〔6〕对采自广州市的阴道毛滴虫28株临床分离株rDNA-ITS序列的分析发现, 有4株具有C66T突变, 还发现1株在ITSG4处有突变; 但进一步分析认为, 这2种突变与甲硝唑耐药性无关。本研究结果表明, 39株中仅有8株在ITS1区具唯一点突变, 即C66T突变, 其余虫株rDNA-ITS序列与文献报道的序列完全一致^〔7〕, 进一步表明阴道毛滴虫不同虫株间rDNA-ITS序列的高度保守性。8株具C66T突变的虫株中有6株来自甲硝唑敏感虫株, 2株来自甲硝唑耐药虫株。经Fish确切概率法检验两者之间差异无统计学意义, 表明C66T突变与甲硝唑耐药性无关, 可能是虫株新近在进化上出现的差异。