脑卒中是一组多因素、多基因疾病, 国内外流行病学已证实吸烟、饮酒、糖尿病, 肥胖等是脑卒中的主要危险因素^〔1〕。随着分子生物学技术的发展, 一系列脑卒中的易感基因被发现。目前在脂联素基因研究中, 发现其多态性与肥胖、冠心病、糖尿病及颈动脉内膜中层增厚等有关, 与脑卒中的关联尚不清楚。因此, 本研究对脂联素基因多态性与我国东北人群缺血性脑卒中的关系进行了分析, 为制定缺血性脑卒中特异性干预措施和建立预测预警系统提供科学依据。

2007年1月-2008年12月就诊于黑龙江省牡丹江市各大医院病人及体检人群。研究对象均在本市居住5年~。病例选择:病例选自牡丹江市第一、第二人民医院和牡丹江医学院附属红旗医院缺血性脑卒中新发病例。诊断标准:按中华神经科学会第四届全国脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点(1995) 》^〔2〕, 根据临床神经功能缺损表现和头部CT或磁共振(MRI)检查确诊。排除标准:排除瓣膜性心脏病、房颤、血液病、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤、自身免疫性疾病等引起的继发性脑卒中患者。对照选择:对照来自研究期间社区健康体检人群, 经病史询问、体检、心电图检查和其他血液生化检查无异常发现, 且以前无脑卒中病史的正常人。对研究对象采用调查问卷方式, 由调查员直接询问病例与对照(患者或其直系亲属)获得调查资料。

在知情同意的原则下采集个体的血样。受检者空腹12~15h过夜, 次日晨8时抽取外周静脉血5mL, 分置于含有2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)100 μL的一次性试管中, 共2管:一管1 mL用于DNA抽提; 一管4 mL用于血浆分离, 置-80℃冰箱内长期保存。基因组DNA的提取:采用Axy Prep血基因组DNA小量提取试剂盒(美国Axygen公司)提取DNA, 存放于-80℃冰箱内。基因型检测:采用荧光定量PCR的Taqman探针法检测脂联素基因多态位点rs2241766、rs226729基因型, 预期扩增片段在300bp左右。反应在荧光定量PCR仪ABI7500上进行并由系统软件根据荧光强度自动分辨所检测位点基因型。引物和探针由上海超世生物科技有限公司合成。位点rs2241766引物:正5′-CT-GTTGCTGGGAGCTGTTCTAC-3′, 反5′-GGCCCTT-GAGTCGTGGTTT-3′; 位点rs266729引物:正5′-TCATCAGAATGTGTGGCTTGC-3′, 反5′-TTGGACTTTCTTGGCACGCT-3′。PCR反应体系为10 μL, 其中含Premix ExTaq^TM2×(DRR039B, 大连宝生物工程有限公司)5.0 μL、上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL、探针-MAR及探针-JUP (20 μmol/L)各0.1 μL、模板DNA 0.5 μL、ddH₂O3.7 μL。反应条件:采用两步法PCR扩增程序, 95℃预变性10 s, 95℃ 5 s和60℃ 32 s共40个循环。

采用Epidata3.0录入数据库。应用SAS9.0统计软件进行分析, 各组间频率运用χ²检验, 计算资料以x±s表示, 2组计量资料比较应用t检验, 3组以上计量资料采用方差分析, 方差不齐则采用非参数检验; 采用Logistic回归分析脂联素基因多态性与缺血性脑卒中的关系; 双尾检验P < 0.05为差异有统计学意义。

入选病例357例、对照345例; 病例组平均年龄为(63.64±11.10)岁, 对照组平均年龄为(53.70±9.05)岁, 病例对照年龄差异有统计学意义(P=0.00)。男女性别比为1.5: 1, 病例对照性别比差异无统计学意义。病例与对照在文化水平、月收入、腰臀围比及BMI差异有统计学意义。病例组的血糖和总胆固醇、甘油三酯均高于对照组(P均 < 0.05)。

人群中脂联素基因rs2241766位点有GG、GT、TT3种基因型; rs266729位点有GG、CG、CC3种基因型。

用Haploview软件对对照中脂联素基因多态位点rs2241766、rs266729的基因型分布频率进行连锁平衡分析。位点位点rs2241766的(HWp)平衡检验P值为0.0823, (MAF)最小等位基因频率为0.20;位点rs266729的HWp为0.1623, MAF为0.25, 均符合Hardy-Weinberg定律。

表 1

表 1 脂联素基因两多态位点的基因型分布与缺血性脑卒中关系

表 1 脂联素基因两多态位点的基因型分布与缺血性脑卒中关系

病例与对照中2位点基因型均存在, 趋势检验结果, 2组间rs2241766位点3种基因型分布频率差异有统计学意义(Z=-3.62, P=0.00), 而rs266729位点3种基因型分布频率差异无统计学意义(Z=-1.16, P=0.25)。分别以TT、CC基因型作为rs2241766和rs266729的参照基因, 则rs2241766位点GG、GT、GG±GT基因型的OR(95%CI)分别为2.30(1.26~4.17), 1.41(1.01~1.97), 1.55(1.14~2.12), 即rs2241766位点等位基因G变增加了缺血性脑卒中的发病风险, 且随着等位基因G的增加危险性也增加; rs266729位点基因型与缺血性脑卒中无关。

表 2

表 2 不同性别2位点基因型与缺血性脑卒中的关系

表 2 不同性别2位点基因型与缺血性脑卒中的关系

研究对象按性别分层后, 趋势检验结果, 不同性别中rs2241766位点各基因型在2组间分布差异均有统计学意义(男性P=0.03, 女性P=0.03), 而位点rs266729差异则无统计学意义(男性P=0.65, 女性P=0.17)。分析显示, 男性rs2241766位点的GG+GC基因型是缺血性脑卒中的危险因素(OR=1.57), 女性rs2241766位点的GG、GG+GC基因型是缺血脑卒中的危险因素(OR分别为2.79和1.79);rs266729位点基因的纯合G变可能增加女性缺血性脑卒中的发病风险(OR=3.25)。

脂联素是由脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质^〔3-4〕。研究表明, 脂联素在降低单核细胞的粘附作用、抑制血小板(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌的增殖与迁移, 抑制肿瘤坏死因子(TNF)的生成与释放及阻止动脉粥样硬化发展等方面都有重要衍生生长因子作用^〔6-9〕, 与多种疾病的发生有关。本研究显示, 脂联素基因rs2241766位点T→G突变与我国东北汉族人群缺血性脑卒中的易感性显著相关, rs266729位点C→G突变与东北汉族女性缺血脑卒中的易感性相关。可能与rs2241766位点T→G突变影响基因的转录或翻译从而影响脂联素的表达^〔10〕及rs266729位点C→G突变可能降低启动子活性而减少脂联素的表达^〔11〕等有关。Hil-laryH^〔12〕等研究发现, rs2241766多态性与美国人群缺血性脑卒中易感性无关, 而rs266729多态性与缺血性脑卒中易感性相关, 与本研究结果不同。因基因表达受基因和环境的共同影响, 故不同种族、不同生活环境均可使结果产生差异。本研究所测指标少, 样本量亦不大, 有关脂联素基因多态性与脑卒中关系的确切结论尚需进一步研究。