氢醌(hydroquinone, HQ)是苯的代谢产物, 在体内可引起急性白血病、血小板减少症、再生障碍性贫血等血液系统疾病, 因此, 造血系统细胞是氢醌的主要靶细胞。前期研究发现, 氢醌可在细胞存活水平诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)产生适应性反应, 即细胞受到低剂量氢醌预刺激后, 可耐受后续高剂量的攻击。在MRC-5耐受与适应模型的研究中, 本研究利用蛋白质组学技术鉴定了与氢醌诱导MRC-5细胞适应性反应相关的蛋白^〔1〕, 包括巯氧还蛋白过氧化物酶(Prxs)和热休克蛋白10(HSP10)家庭成员, 其中含2个半胱氨酸活性位点的2-CysPrxs (包括Prx1-4)和SHP10特别令人关注。研究表明, NAD (P) H:醌氧化还原酶(NQO1)具有保护苯致血液系统毒性的作用, 氢醌可诱导骨髓CD34⁺细胞NQO1表达, 减轻氢醌所致的细胞毒性及细胞凋亡^〔2〕。本研究检测氢醌刺激脐血单个核细胞(umbilical cord blood mononuclear cells, UCBMC)诱导适应性反应, 并探讨NQO1、HSP10及2-Cys Prxs在其中作用。

新鲜脐血取自广西医科大学第一附属医院健康足月产新生儿脐带血, 无菌采集, 枸橼酸钠抗凝。

杜尔贝克(IMDM)培养基(美国Hyclone公司); 羟基淀粉、梯度细胞分离液(Ficoll-Paque)、无血清液体培养基(Stemspan^TM SFEM, 加拿大Stemcell公司); Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美生物公司); cDNA合成试剂盒PCR试剂盒与荧光定量PCR引物(沈阳TakaRa公司); Tr-izol (美国Invitrogen公司)。其余试剂为国产分析纯。

取脐血, 5:1加入羟基淀粉, 室温静置30~40min, 收集上清及有核细胞层, 用含2%胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞, 重悬, 按1:1比例加入Ficoll-Paque中, 室温400g离心30min, 去除上层液体, 取单个核细胞层, 2% IMDM清洗, Stemspan^TM SFEM重悬。

根据HQ刺激MRC-5细胞产生适应性反应的剂量^〔1〕, 分对照组, 低剂量组、适应性反应组和高剂量组, 每组5孔/管, 各组细胞数为2×10⁶个/mL。选择预刺激的低剂量为10μmol/L, 作用时间12h;高剂量250μmol/L, 作用时间5 h。

UCBMC离心, 弃上清, PBS重悬, 调节细胞浓度至1×10⁶个/mL, 分别加入5 μL磷脂蛋白荥光素(Annexin V-FITC)和/或10 μL溴化丙啶(PI), 避光15min, 每管加入400 μLPBS、1 h内上机检测。

取各实验组UCBMC, 弃培养液, 加入1 mL Trizol, 室温放置10 min, 加0.2 mL氯仿, 振荡15 s, 静置3 min, 4℃, 12000 g离心15 min, 取水相加入0.5 mL异丙醇, 室温放置10 min, 4℃, 12000 g离心10 min, 75%乙醇洗涤干燥后溶于纯焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水, 紫外分光光度仪检测提取总RNA质量和浓度。要求A260/A280在1.8~2.1范围, 并计算RNA含量。

反应体系20 μL, 取随机引物(100 μmol/L) 1 μL, 每一标本取总RNA 1 μL, RNA酶抑制剂(40 U/μL) 0.5 μL, dNTP混合物(各10 μmol/L) 1 μL, 5倍反应缓冲液4 μL, 逆转录酶100 U, 加DEPC水至20 μL。按42 ℃ 30 min, 95 ℃ 2 min, 进行逆转录。合成好的cDNA置于-20℃保存备用。

25 μL反应体系中包括:上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 2倍混合液12.5 μL (包括反应缓冲液、dNTP、MgC1₂、SYBRGreenI、Taq酶), 双蒸水10.7 μL, cDNA标本1 μL。各基因扩增片段长度如下:HSP10为143bp, NQO1为107bp, Prx1为141bp, Prx2为129bp, Prx3为98bp, Prx4为75bp。以β-actin基因为内参, 相对表达量的计算公式为:ΔΔCT=ΔCT待测基因-ΔCT内参基因, 平均相对含量=2^{-平均ΔΔCT}。

采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析。

表 1

表 1 HQ刺激UCBMC流式分析结果(n=5。x±s)

表 1 HQ刺激UCBMC流式分析结果(n=5。x±s)

结果显示, UCBMC受到10 μmol/L氢醌预刺激12 h后再给予250 μmol/L氢醌刺激, 与单独使用250 μmol/L大剂量氢醌刺激的细胞比较, Annexin V^-/PI^-细胞百分比升高, Annexin V⁺/PI⁺细胞百分比降低, 出现适应性反应。

表 2

表 2 HSP10、NQO1、Prxl-4基因在UCBMC的表达(x±s)

表 2 HSP10、NQO1、Prxl-4基因在UCBMC的表达(x±s)

总RNA凝胶电泳后, 28 s亮度明显强于18 s, 5 s很弱, 说明RNA完整性较好, 分光光度计测A260/A280在1.8~2.1。各目的基因在UCBMC表达相对定量检测结果显示, NQO1、Hsp10、Prx1~4各引物融解曲线均呈清晰的单一峰型, 各基因表达Ct值在16~25。各基因的相对表达量在0.8~4, 与空白对照组比较, 高剂量组HSP10、Prx3、Prx4表达明显增高, 适应组Prx1明显增高。NQO1在高剂量组和适应组表达均较空白对照组明显增高, 且与适应组比较有明显差别。

机体在受到低水平环境因子刺激后, 可能诱导产生一系列保护性反应, 从而产生适应现象。氢醌是一种潜在的氧化剂, 氧化损伤是氢醌的主要毒作用机制之一。研究表明, 氢醌可降低细胞内谷胱甘肽和蛋白巯基水平, 升高细胞内活性氧, 改变细胞内氧化还原状态而对细胞造成损伤^〔3-4〕。细胞受到低于损伤剂量氢醌刺激时, 可能激活一些氧化应激相关的蛋白, 使细胞对后续强烈的氧化刺激产生耐受和适应反应。本研究结果显示, 与空白对照组比较, HSP10及2-CysPrxs表达在低剂量组均未见明显差异, 但在高剂量组或适应组表达增高, 提示这些基因的表达参与了HQ诱导的适应性反应, 但并非处于适应性反应机制的上游阶段。NQO1在适应组及高剂量组均持续表达增高, 提示NQO1主要参与HQ的细胞毒性反应, NQO1高表达有利于保护细胞免于死亡。Prxs是一类抗氧化蛋白, 可抑制金属催化的酶氧化反应, 保护细胞免受氧自由基损害, 不同的Prxs成员在抗氧化中的功能及激活途径等各有不同。本研究结果也显示, 各Prxs在HQ诱导的脐血单个细胞适应性反应中表达不尽相同, 其中Prxs4表达在适应组和高剂量组间差异有统计学意义, 提示Prxs4在其中起重要作用。