S100A4蛋白属于S100蛋白家族, 是由101个氨基酸组成的多肽, 分子量为11.5k D, 也被称为Mts1、metastasin、p9Ka、CAPL (calcium protein placental homolog)、calvasculin、Fsp-1(fibroblast -specific protein)和胎盘钙结合蛋白。研究表明, S100在很多疾病中表达异常, 包括银屑病、阿希海默病、胆囊纤维化、心肌病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化和癌症等^{〔1, 2〕}。S100A4蛋白与不同的分子靶标结合, 发挥不同的生物学作用, 研究证实, S100A4蛋白胞内的分子靶标为原肌球蛋白(tropom yosin)、非肌肌球蛋白重链ⅡA (heavy chain of nonmuscle myosin ⅡA, MHCⅡA)、p37、S100A1、p53、甲硫氨酸氨基肽酶(methionine aminopeptidase 2)、liprin β1和CCN3 (cysteine-rich61/connective tissue growth factor /nephroblastoma overexpressed^〔3〕.为探讨S100A4蛋白与靶标蛋白之间相互作用, 以阐释该蛋白在发挥生物学功能的可能作用机制, 现对主要分子靶标与钙结合蛋白S100A4关系研究进展作一综述。

1 S100蛋白与原肌球蛋白相互作用对细胞骨架动力学影响

在大量免疫荧光染色实验中观察到, S100A4蛋白与细胞骨架结构的共定位, 并且还发现S100A 4蛋白与细胞微丝的作用密切相关。在B16黑素瘤细胞中, S100A4蛋白的表达对细胞微管动力学的发挥产生影响。免疫荧光实验与生化研究的结果非常吻合, 证实了这些靶标蛋白与S100A4蛋白的相互作用。在体实验中, 非肌原肌球蛋白和MHCⅡA都表现出S100蛋白可能的靶标特性。但最近研究证实, 只有MHCⅡ可与S100A4蛋白直接相互作用^〔3〕。

肌球蛋白是分子动力蛋白, 利用三磷酸腺苷(ATP)水解产生的能力与肌动蛋白丝相互作用产生收缩力。不同类型的肌球蛋白结构相似, 均由轻链和重链组成。依据重链头域序列, 把肌球蛋白分成20个等级。它们均在真核细胞中表达^〔4〕。肌球蛋白ⅡA属于常规肌球蛋白分子的第Ⅱ等级, 在体实验中能形成双极蛋白丝或在离体实验中以相对较低的离子浓度形成离子力。肌球蛋白ⅡA是一个六聚体蛋白, 由1对重链(200kDa)和2对轻链(20和17kDa)构成。其中1对轻链作为调控轻链, 而另外1对则为必需轻链。每一个重链包括3个区域:包含ATP和肌动蛋白结合位点的球形头域、α螺旋状的卷曲螺旋尾域或柱状域和羧基末端螺旋状尾域^〔5〕。

离体实验中, 钙离子参与条件下, S100A4二聚体可与MHCⅡA相互作用^〔6〕。最初研究中, 标定S100A4蛋白与MHCⅡA分子的结合位点为S100A4蛋白序列的C末端1909~1937号氨基酸^〔7〕。后来研究证实, 在2.7~3.59μmol/L范围内, S100A4蛋白与MHCⅡA的杆状域(1339-1961)或GST -MHCⅡA的衍太肽(1900~1961, 1909~1940)的亲和力达到解离平衡状态。然而, S100A4蛋白与较短的GST-MHCⅡ A肽(1909~1924)相互作用的稳定性很差(Kd6.57 μmol/ L^〔8〕。用从血小板中提纯的原肌球蛋白或MHCⅡA柱状域重组体的不同片段进行试验证实, S100A4与MHCⅡ A的结合可调节肌球蛋白丝的形成。用等摩尔浓度的S100A4二聚体与MHCⅡA柱状域片段进行实验, 在MHCⅡA柱状域片段重组体中检测到生理离子溶液中肌球蛋白恢复率接近85%^{〔8, 9〕}。因而, 离体实验发现, S100A4还可作为非肌肌球蛋白ⅡA的钙依赖调节因子发挥新的作用^〔3〕。

S100A4-myosin相互作用的重要意义已经在很多在体实验中得到进一步确证。对大鼠乳腺癌MTC细胞进行化学趋化实验, S100A4的异位表达或微注射一种抗体到S100A4-myosin结合位点都会刺激细胞前凸的形成, 并且直接促进细胞迁移^〔10〕。

综上所述, S100A 4展现了分子伴侣的特征, 并通过调节单体与聚合态肌球蛋白间的平衡来保持可溶性原肌球蛋白的集聚状态。

2 S100A4蛋白与Liprin β1的相互作用

免疫沉淀作用分析证实, S100A4与细胞溶解蛋白Liprin β1是一个复合体^〔11〕。在胞质中尤其在质膜的凸出位点上, 免疫荧光显示, S100A4蛋白与细胞溶解蛋白Liprin β1的共定位。利用印迹覆盖技术(Blot overlay technique)检测结果表明, S100A4蛋白与Liprin β1分子的结合位点标定在C-末端的第938与1005号氨基酸残基之间^〔3〕。

Liprin β1是一个分子量为105kDa的细胞溶解蛋白, 也是从酵母捕获测定(yeast trap assay)实验中获得的一个与Liprin α1相互作用的配体。α-liprins和β-liprins同属一个蛋白家族, 它们结构上相关, 且特点相同, 即都具有与LAR蛋白质酪氨酸磷酸酶(LAR protein tyrosine phosphatase, LAR)形成复合物的能力^〔12〕。

α-liprin-LAR复合体能使酶聚集到黏着斑上^〔13〕。α-liprins和β-liprins可以相互作用, 但不能与LAR直接相互作用^〔12〕。2组liprins都具有N末端的卷曲螺旋区域。这不仅与同源二聚体的形成有关, 还会影响C末端非螺旋区域通过Liprin homology domain (LH)形成重要的异源二聚体。Lip-rins的LH区域包含3个Sterile alpha Motif (SAM)区域。该区域参与了蛋白-蛋白相互作用, 并且是信号转导及细胞骨架蛋白的成员之一^〔14〕。S100A4在紧密靠近LH区域附近与lip-rin β1相互作用, 也会对liprin α1的LH区域发生的相互作用产生影响^〔11〕。

所有的liprins都包含磷酸化丝氨酸/苏氨酸位点。研究显示, liprin α1拥有激酶活性, 并且liprin α1的自动磷酸化在与LAR的相互作用中发挥着极为关键的作用^{〔12, 15〕}。离体实验中, S100A4-liprin β1的相互作用通过蛋白激酶(PKC)和血清肌酸激酶2(CK2)通路抑制了liprin β1的磷酸化^〔11〕。因此推测, S100A4通过改变liprin β1的磷酸化来调节与liprins的相互作用的状态。

研究表明, liprin α1是一种细胞骨架蛋白, 可与很多信号分子相互作用。这些信号分子参与调控突触形成及神经递质释放过程。近年来发现, liprinα1在突触中的功能是聚集LAR到激活区域和携带底物LAR-复合体所在的间隙组织中^〔16〕。对LARl/iprin α1相互作用详尽分析提示, 与liprinα1的结合位点标定在LAR分子中末梢磷酸酶D2区域^〔13〕。该区域无催化活性, 但参与底物特异性的调控。另外, 临近D1区域具有磷酸酶活性^〔17〕。

LAR是一个多功能蛋白, 主要参与细胞-细胞间的粘附、细胞-基质间的相互作用及细胞骨架重塑等。敲除大鼠的LAR基因后, 主要观察到乳腺增生和轴突导向上出现表型缺失^〔18〕。然而, 另一个LAR D2 domain-interacting protein是鸟嘌呤核苷酸交换因子Trio, 它通过成簇黏附激酶(focal ad-hesion kinase, FAK)而被磷酸化, 但可调控该酶的活性^〔19〕。因此, Trio聚集黏附到细胞膜上可能代表了LAR介导细胞黏附调控的机制。还有一个分子就是β-catenin, 可以通过该分子的作用从机制上解释LAR的功能与细胞黏附之间存在联系^〔20〕。

多种磷酸化酶都有潜力改变β-catenin磷酸化状态。研究表明, 这些酶中的LAR与E-cadherin-catenin复合体共定位于上皮细胞, 同时在β-catenin的Tyr654号位点去磷酸化^〔20-21〕。此外, 研究提示, 人LAR在大鼠膀胱癌细胞系NBTⅡ中的异位表达与抑制β-catenin的磷酸化以及上皮细胞的迁移有关^〔20〕。且LAR的异位表达抑制了裸鼠的肿瘤形成。显然, LAR的功能异常会通过酪氨酸磷酸化或干扰与E-cad-herin的相互作用来影响β-catenin的稳定性, 进而有利于肿瘤的侵袭与转移^{〔16, 21〕}。

自从liprin β1的重要性得到确认以来, 关于其功能的信息仍然非常有限。因此, liprin β1/S100A4相互作用的功能序列并不清楚。研究提示, S100A4可能是liprin α1/β1复合体的钙依赖性调节因子。

3 S100A4蛋白与p53蛋白的相互作用

肿瘤抑制因子p53在人恶性肿瘤中的突变发生率达50%, p53的损耗是细胞周期调控和凋亡分子机制反常的原因, 也是癌症发生发展的关键步骤之一^〔22〕。复杂的信号通路网络紧密地调控着p53的活性、稳定性及转运功能。研究发现, S100蛋白家族的3个成员, 即S100B、S100A2和S100A4以一种钙依赖的方式与p53的C末端区域从生理上发挥相互作用。与S100蛋白的相互作用可能会影响p53的磷酸化及乙酰化, 导致p53亚细胞定位及转录活性的调节。p53/S100相互作用代表了p53-与钙依赖细胞通路之间互相干扰的例证^〔23〕。

Grigorian M等^〔24〕报道, S100A4与p53之间有自然的相互作用及机能上的相互影响。研究显示, S100A4通过PKC途径抑制p53的磷酸化, 并在特异启动子存在背景下抑制p53的转录活性。与S100A4优先作用位点, 标定在p53四聚体化的325-355氨基酸区域; p53/S100A4复合体的形成促使p53四聚体的解离^〔25〕。而p53四聚体化阻碍与S100A4的相互作用。这种作用模式与S100A4与MHCⅡA相互作用产生的效果相似, 比如S100A4结合成复合体会通过PKC途径抑制MHCⅡA的磷酸化, 促进原肌球蛋白分解^{〔3, 9〕}。研究表明, S100A4促例p53降解^〔25〕。

研究提示, p53在调节细胞活力及粘附方面具有重要作用。具有p53^-/-的成纤维细胞展现了迁移能力升高的特性^〔26〕。尽管对这条通路还难以综合理解, 但Cdc42的细胞传播和上游极化过程中, p53似乎是抑制了细胞丝足的形成^〔27〕。若S100A4蛋白在细胞迁移中的作用得以确证, 那么p53的功能或许尤其与p53/S100A4的相互作用有关。研究表明, 肿瘤中高水平的S100A4可能会通过阻止p53的四聚体化以及促进其降解来抑制p53的活性。S100A4介导的p53对Cdc42功能调控能力的降低, 将增强细胞的迁移, 有利于肿瘤的转移^〔3〕。

4 结论

综上所述, S100A4蛋白是一个多功能钙结合蛋白, 与多种靶蛋白相互作用的特点决定其生物学作用的多样性。研究表明, 正常或病理条件下, S100A4与胞内蛋白正常或异常的相互作用均会对细胞迁移产生不同影响, 而微环境、局域浓度以及肌肉的初期钙化是决定S100A4与其特定靶标相互作用的关键因素, 并对细胞迁移的特异信号的调节通路具有微调作用。受S100A4影响的分子通路与癌细胞的活性及侵袭力密切相关。因此S100A4可能代表了一种新的无毒的治疗靶标, 用以抑制癌细胞的迁移扩散。随着RNA干扰技术(RNAi)的应用, 通过调节S100A4在细胞内的表达水平也是非常有意义的治疗方式。研究发现, 多种化合物具有与p53结合位点竞争的能力, 从而对S100/p53的相互作用产生影响。但仍然不能确定他们是否对S100的靶标具有阻断作用。可以从化学组合基因库中筛选一些小分子化合物, 运用它们来调控S100A4与其靶标之间特异的相互作用。将来, 这些潜在的非毒化合物有可能成为限制癌细胞迁移和侵袭能力的新药物。