目前, 测定环境中微量酚的方法主要有4-氨基安替比林分光光度法^〔1〕和色谱法^〔2〕, 但这些方法或繁琐费时、灵敏度不高或所需仪器昂贵, 难以实现在线监测。本研究通过在多壁碳纳米管-Nafion复合修饰玻碳电极上固定酪氨酸酶, 构建电流型测酚生物传感器, 并用循环伏安法和计时电流法探讨传感器的催化性能。结果表明, 该传感器对酚类化合物具有快速良好的响应, 测定的灵敏度高, 有较好的重现性和稳定性, 并可用于实际水样的分析。

1 材料与方法 1.1 仪器和试剂

CH I660A型电化学工作站(上海辰华仪器公司), 采用三电极系统:酪氨酸酶修饰电极为工作电极, Ag/AgCL (饱和KCL溶液)电极为参比电极, 铂丝电极为对电极。酪氨酸酶(Tyr, EC 1.14. 18.1, 2 870U/mg, 从蘑菇中提取, 美国S igm a公司); 多壁碳纳米管(MWCNT, 南京大学化学化工学院生命分析化学教育部重点实验室; 5% (w/w) Nafion (美国Sigm a公司); 苯酚、邻二苯酚、对甲苯酚(上海国药集团化学试剂公司); 其他试剂均为分析纯, 实验用水为二次蒸馏水。

1.2 酪氨酸酶传感器的制备

首先将5%Nafion用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)稀释配成0.5% Na fion溶液。取5 mg酪氨酸酶和5 mgMWCNT加入1 mL的0.5% Nafion溶液中, 超声分散1 h得均一、浅黑色的混合分散液。玻碳电极(有效直径为3 mm)依次用0.3, 0.05 μm的Al₂O₃粉及麂皮抛光至镜面, 然后依次在无水乙醇和二次蒸馏水中超声清洗3 min, 红外灯下烘干。取10 μL上述混合分散液滴加在玻碳电极表面, 室温干燥1 h后置于pH 7.0磷酸盐缓冲液(PBS)中, 4℃冰箱保存。

1.3 实验方法

采用上述三电级系统置于含10 mL PBS的电解池中进行电化学测量。循环伏安实验在空气饱和、静止状态下进行; 恒电位安培检测实验在空气饱和、搅拌条件下进行。在工作电压下, 待背景电流稳定后迅速加入一定量的苯酚等酚类化合物溶液, 记录电极对酚类化合物的电流响应。所有测量均在室温下进行。

2 结果 2.1 苯酚在酪氨酸酶传感器上的电化学行为

采用循环伏安法, 测定时以100 mV/s的扫速在0.50~-0.40 V区间进行循环扫描。结果表明, 在空白底液中酪氨酸酶传感器未观察到明显的氧化还原峰, 但当加入1.0×10^-4 mol/L苯酚后, 于-0.04 V出现一灵敏度高、峰形较好的还原峰, 当再加入一定量苯酚时, 还原峰电流继续增加。在同一实验条件下, 邻二苯酚、对甲苯酚等酚类化合物在该传感器上也显示出类似的电化学行为。

2.2 测定底液pH值的影响

测定底液的pH值会影响固定化酪氨酸酶的活性大小, 同时也影响有质子参与的苯酚催化氧化还原过程。结果表明, 在pH < 7.0时, 电流响应随pH值增大而增加, 这是由于酶活性增加的缘故; 当pH > 7.0时, 电流响应随pH值增大而减少, 这是因为酶活性逐渐下降, 同时溶液可提供的质子数明显减少; 当pH=7.0时电流响应达到最大值。

2.3 工作电压的影响

当工作电压从100 mV降至-150 mV时, 酶传感器响应电流迅速增加, 这是因为电压越低, 邻苯二醌发生电化学还原的驱动力越大, 当电压低于-150 mV时, 电流响应变化明显减弱, 而且测定底液中的溶解O₂在较负电压下在电极上还原的可能性增大, 使背景电流增大, 灵敏度开始下降。

2.4 酪氨酸酶传感器的响应特性(表 1)

在上述优化的测定条件下, 每隔1 min用微量进样器连续加入1.0×10^-6 mol/ L苯酚溶液, 考察该酶传感器的响应特性。随着苯酚的不断加入, 传感器表现出快速的响应, 达到95%稳定状态时所需时间不超过10 s。另处, 酪氨酸酶传感器对邻二苯酚、对甲苯酚也显示出良好的响应特性。

2.5 酪氨酸酶传感器的重现性与稳定性

用同一酶传感器对1.0×10^-6 mol/L苯酚平行测定8次的相对标准偏差(RSD)为3.52%。按相同方法制备4支酶传感器, 对1.0× 10^-6 mol/L苯酚测定电流的RSD为5.08%, 表明所制备的传感器具有良好的重现性和重复性。另外还观察了该传感器的贮存稳定性。当酶传感器不用时置于冰箱中保存, 1个月后响应电流仍能保持原始响应的90%;当酶传感器每隔1 d进行测定, 2周后响应电流下降到原始响应的70%左右, 表明所制得的传器具有良好的稳定性。

2.6 实际检测(表 2)

为了检验该酶传感器的实用效果, 在上述优化实验条件下, 以苯酚作为标样, 采用标准加入法, 测定取自南通市区不同地域河流的5种实际水样中的酚类化合物的含量。为了验证测试结果, 同时应用标准4 -氨基安替比林分光光度法进行对照测定实验, 2者结果基本吻合, 表明酪氨酸酶传感器可以用于实际水样分析。

3 讨论

本研究所制酶传感器是基于苯酚首先被溶解O₂氧化形成邻苯二酚, 邻苯二酚再被酪氨酸酶催化氧化为邻苯二醌, 邻苯二醌可以在电极表面迅速还原成为苯二酚, 从而产生还原信号并用于检测。而还原电流的产生表明, 酪氨酸酶已成功地固定在电极表面而且保持了良好的生物催化活性。

优化测定条件结果显示, 当pH=7.0时电流响应达到最大值, 表明此时固定化酪氨酸酶活性最高, 与文献报道的其他相一致^〔3-4〕。同时为了得到最佳信噪比, 选用pH=7.0的磷酸盐缓冲液作为测定底液, -150 mV作为恒电位安培检测的工作电压。总之, 该传感器对酚类化合物具有快速良好的响应, 可用于实际水样酚类化合物含量的检测。