传统测定汞的方法有冷原子吸收法、原子荧光法和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术等^〔1-3〕, 这些方法检测灵敏、准确性高, 但是需要昂贵仪器、操作复杂、费力。为了满足快速检测的需要, 人们开始研究酶法和微生物法, 即利用毒性物质对酶活性和微生物活性的抑制作用而建立的毒性评价方法。有报道^〔4-5〕, 通过土壤细菌脱氢酶活性变化评价土壤微生物活性和重金属污染情况。由于微生物法检测汞污染具有简单、快速、灵敏等优点, 本实验通过分离土壤菌获得有意义的单菌落, 而后以2, 3, 5-三苯基四氮唑(TTC)为底物, 检测土壤菌脱氢酶活性被汞抑制的程度来评价水中汞毒性大小。

1 材料与方法 1.1 仪器

ELX800酶标仪(美国BIO-TEK公司); CO₂培养箱(德国MEMMER公司); HZQ-X100振荡培养箱(中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司); DK-8A型电热恒温水浴糟。

1.2 试剂

质量分数为0.4 %的TTC (上海朝瑞生物科技有限公司); 三羟甲基氨基甲烷(Tris) -HCl缓冲液(pH 8.4);氯化汞(华中师范大学惠赠); 硫柳汞(上海化学试剂采购供应站)。

1.3 实验基本设计原理

从土壤混合菌中筛选出对汞最为敏感的单菌, 将不同浓度的氯化汞和硫柳汞分别作用于该菌培养液, 得到毒性和脱氢酶活性抑制率间的关系曲线, 从而建立一种检测水中汞毒性的生物学方法。

1.4 培养基的配制

按照文献〔6〕方法。

1.5 土壤单菌落培养和筛选

取树林下10~15 cm的土壤, 用天然雨水浸泡1 d, 用无菌注射器取上清液5 mL按种到100 mL上述培养基, 37℃摇床培养20 h; 划平板进行土壤菌分离, 挑取单菌落再接种到20 mL培养基, 37℃摇床培养20 h, 通过抑菌圈进行粗选, 挑出对汞较为敏感的2种菌, 分别为1号菌和2号菌。再通过硫柳汞对这2种菌脱氢酶活性的抑制实验, 选出对汞最敏感而且菌落特征明显, 长势较好的1号菌作为实验菌。将该菌扩大培养, 放入4℃冰箱备用。

1.6 酶抑制实验过程

将氯化汞和硫柳汞用双蒸水配成不同浓度梯度, 分别为5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.312 5, 0.156 25 mg /L。采用96孔酶标板, 在每个反应孔中依次加入菌液10μL, 毒液50μL, 37℃水浴30 min; 然后加入培养基40μL, 37℃水浴继续作用90 min; 在室温下, 加入TrisHCl (pH 8.4) 100μL, 之后加入TTC溶液50μL启动反应(Tris-HCl和TTC加入前再37℃预热10 min)。3 min后加入50μL甲醛终止反应。用双蒸水替代毒物作为空白。用酶标仪在490 nm测吸光度(A)值。毒物对脱氢酶活性的抑制率(DHA) (%)=(DHA_空白 -DHA_样品) /DHA_空白×100。

1.7 显色时间的确定

做硫柳汞对脱氢酶活性的抑制实验, 从加入TT C底物开始计时, 分别在第3, 第7, 第14, 第20 min检测不同浓度硫柳汞对土壤单菌脱氢酶的抑制作用。

1.8 菌液脱氢酶稳定性测试

将培养好的菌液放在4℃的冰箱存放。分别在第1和第9 d利用脱氢酶活性抑制法检测该酶的活性, 从而评价菌液脱氢酶的稳定性。

1.9 统计分析

采用Origin 8.0软件进行统计分析。

2 结果 2.1 细菌脱氢酶抑制法检测饮水中汞的效果 2.1.1 土壤敏感菌筛选结果(图 1)

从图 1可见, 1号菌和2号菌培养液的脱氢酶活性随着硫柳汞浓度的增大而逐渐降低, 并在一定范围内呈现线性关系。当汞浓度达到2.5 mg/L左右, 1号菌脱氢酶活性抑制率达到最大, 约为48.7%, 2号菌脱氢酶活性抑制率仅24.3 %。1号菌比2号菌对汞毒性更为敏感, 因此, 选用1号菌作为实验菌。

2.1.2 汞对细菌脱氢酶活性抑制曲线(图 2)

从图 2可见, 氯化汞和硫柳汞的浓度越大, 对细菌脱氢酶活性抑制率越大, 呈现良好的剂量-效应关系。将脱氢酶活性抑制率为20%所对应的汞离子浓度定义为检测限, 则氯化汞的检测限为2.7 mg/L, 硫柳汞的检测限为0.7 mg/L。参见文献^〔7〕的计算方法, 得到硫柳汞的半数酶活性抑制浓度(EC₅₀)为0.86 mg/L。其中, 汞浓度为2.5 mg/L时, 硫柳汞对脱氢酶活性抑制率达到最大, 为53.3%, 比氯化汞高出32.7%, 说明该细菌脱氢酶对硫柳汞的检测灵敏度要高于氯化汞。

2.2 细菌脱氢酶抑制法显色稳定性及菌液存放稳定性测试 2.2.1 显色时间对脱氢酶作用效果的影响

实验结果表明, 20 min内, 显色时间对检测结果没有明显影响(P > 0.05)。酶作用快速、灵敏、显色时间能够在较长时间保持稳定。选取3 min时间作为最佳显色时间。3 min是可以用肉眼判断颜色区别的时间, 检测时根据实际情况进行调整。

2.2.2 存放时间对细菌脱氢酶活性的影响

实验结果表明, 第1与第9 d菌液脱氢酶活性比较差异无统计学意义(P > 0.05)。表明在4℃存放条件下, 菌液能在较长时间保持活性, 可以多次使用。

3 讨论

目前, 利用脱氢酶活性抑制法进行饮用水毒性评价的研究较少。有研究以刃天青^〔6〕和亚甲基蓝^〔8〕为底物利用细菌脱氢酶抑制法检测Hg²⁺, EC₅₀分别为1, 0.2 mg/L。本实验室也对亚甲基蓝和刃天青进行了毒性抑制实验。其中, 亚甲基蓝为底物的反应是褪色反应, 当Hg²⁺浓度较低的情况下, 则很难用比色法分辨出反应的变化; 以刃天青为底物颜色反应复杂, 产物萃取困难, 实验误差增大。而TTC作为脱氢酶底物的反应条件已经很成熟, 与以往TTC法对比, 本实验中反应过程在96孔酶标板上进行, 反应完后直接在酶标仪上读数, 不需要离心和提取, 操作简单, 缩短了检测时间。另外, 文献报道^{〔6, 8〕}方法采用的均是土壤混合菌, 而本实验采用的是单一菌。混合菌脱氢酶对毒物的敏感性虽然高于单一菌, 但采用单一菌检测更稳定、更易于标准化。综上所述, 本方法的建立为今后利用脱氢酶活性抑制法评价水质重金属综合毒性提供了基础依据。