1992年, Okumura M等研究三聚氰胺的毒理作用, 发现三聚氰胺能导致实验动物膀胱结石形成, 并具有致癌性^〔1〕, 之后的研究得到了相同的结论^〔2-3〕。2007年3月, 美国食品药品管理局(F D A)在宠物食品中发现了三聚氰胺(mela-mine)。随后, FDA和欧洲食品安全机构(EFSA)对三聚氰胺进行了初步风险评估^〔4〕。由于在饲料、宠物食品、乳制品、鸡蛋、水产品中检出三聚氰胺的报道引起了人们对食品安全的更多关注^〔5〕, 国家有关部门相继发布了饲料、乳制品中三聚氰胺检测方法。目前常用的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、酶联免疫法、光电比色浊度法等。本研究对其检测技术研究进展作一综述。

1 三聚氰胺的检测方法 1.1 高效液相色谱法(HPLC)

2007年4月, 美国FDA公布了高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)检测和定量三聚氰胺^〔6〕。此法是将净化样品经C8色谱柱分离后, 流动相为缓冲液(10 mmol/L柠檬酸, 10 mmol/L辛烷磺酸钠)85:乙腈15, 流动相流速1.0 mL/min, 检测波长240nm, 用紫外检测器进行检测和定量。三聚氰胺分子是非常亲水的小分子, 在常规的反相色谱中不保留, 因此不能与其他物质进行分离。一般情况下, 对于亲水性的化合物可以在溶剂中加入离子对试剂, 使样品在反相柱上保留, 与其他杂质进行分离。在对三聚氰胺的检测中, 加入的是辛烷磺酸钠^〔6〕(sodium octane sulfon-ate)或庚烷磺酸钠^〔7〕(sodium heptane sulfonate)。此法的检测限通常达到2 mg/kg, 我国目前的行业标准和国家标准也推荐这一方法。

这一方法的局限是如果分析样品过于复杂, 会面临复杂基质干扰的问题, 在色谱上可能出现共洗脱现象, 而紫外检测不能准确分辨, 从而影响方法的灵敏度和准确度。此外, 紫外检测的灵敏度极限为mg/kg水平^〔6〕, 且不能提供待测物结构信息。

1.2 气相色谱-质谱联用法(GC-MS)

气相色谱-质谱联用法是利用气相色谱对化合物进行分离, 然后利用质谱鉴定化合物, 此法的定量灵敏度通常可以达到μg/kg水平^〔8〕, 常用于对筛选后的阳性样品进行确证。2007年5月, 美国FDA公布了GC-MS检测确认和定量三聚氰胺的方法, 这一方法很快得到了美国农业部食品安全与监督署(FSIS)的认可。此法是将净化样品用N, O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)和1%三甲基氯硅烷(TM-CS)衍生化后经苯基甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱分离, 质谱检测, 使用电子电离源(EI), 离子扫描。FDA公布该方法检测食品中三聚氰胺的最低报告水平(minimum reporting level, MRL)是10mg/kg^〔9〕, 我国的行业标准和国家标准也推荐了此方法, 方法定量限(limit of quantitation, LOQ)为50~5 μg/kg^{〔7, 10〕}。

三聚氰胺是非挥发性物质, 必须进行相对复杂的样品前处理以及衍生反应才能利用GC-MS检测, 因此, 其检测过程较为繁琐, 衍生过程也会影响到检测的灵敏度和重复性, 这给复杂基体样品中痕量三聚氰胺的定量检测带来一定的难度。

1.3 液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS; LC-MS)

使用液相色谱和串联质谱联用(LC-MS/MS)对化合物进行分离鉴定, 它的检测灵敏度也可达到μg/kg水平, 而且不需要做衍生化反应, 因此, 是目前检测和定量三聚氰胺最灵敏的方法。

最常用的反相色谱柱是C18和C8色谱柱, 三聚氰胺在常规反相色谱柱上很难达到有效的保留, 无法与基质有效分离, 通常加入离子对试剂进行改善, 而目前使用的离子对试剂如辛烷磺酸钠不易挥发, 给LC/MS的电喷雾离子源(ESI)带来极大的影响, 无法和质谱联用。面对这种情况, 2007年5月, 美国FDA兽药研究中心推出了HILIC色谱技术(亲水相互作用色谱法), 在正相色谱柱上采用含水的流动相解决了三聚氰胺的保留问题, 同时保证了ESI不受影响。该研究中心使用配备了Thermo Scientific AccelaTM高效液相系统的TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪, 检测出鲶鱼提取物中的三聚氰胺, 建立了监测加工食品中的三聚氰胺及其水解产物的LC-MS/MS方法^〔11〕。2008年10月, 美国FDA兽药研究中心使用Thermo TSQ Quantum三重四极杆质谱仪检测了婴儿配方奶粉中的三聚氰胺和三聚氰酸, LOQ为0.025 mg/kg^〔12〕。美国FDA食品安全和营养中心, 使用配备了ThermoFinnigan Surveyor高效液相系统的ThermoFinnigan TSQ Quantum质谱仪, 检测出鱼组织、配方奶以及婴儿配方奶粉中残留的三聚氰胺和三聚氰酸, 组织和液体中三聚氰胺LOQ达到0.025 mg/kg, 固体物中为0.2 mg/kg^〔13〕。亲水相互作用色谱法存在重现性差和平衡时间长的缺点, 柱效和分离效果也不如反相色谱法。此外, 高有机溶剂的流动相也容易使样品在进入质谱时离子化不完全, 从而降低灵敏度。有研究采用离子交换-反相混合色谱法^〔14〕, 我国国标采用了这一方法, 其方法LOQ为10 μg/kg^〔10〕。但该方法由于相关色谱柱不易获得, 且制造过程难以重复, 到目前为止未被FDA采用^〔13〕。吴庆庆等^〔15〕采用了七氟丁酸(HFBA)作为一种质谱兼容的离子对试剂, 可以使三聚氰胺在反相色谱上被保留, 且该试剂沸点低, 易挥发, 不干扰质谱的在线检测, 完全适用于液相色谱-质谱法(LC-MS)检测和定量三聚氰胺。此外, 采用内标法和多反应监测方法进一步增强了定量的准确性。基于这一方法, 目前对三聚氰胺的检测方法LOQ已达到0.1 μg/kg, 在液态奶中的定量限为8 μg/kg, 在固体奶粉中的定量限为15 μg/kg。这一方法采用常规的C18反相液相色谱系统, 操作简单, 稳定性和重复性比其他LC-MS/MS更为优越, 使其成为三聚氰胺实验室检测的一个更好选择。液相色谱-质谱联用法的检测灵敏度可以达到μg/kg水平, 但仪器价格昂贵限制了其推广使用。

1.4 其他方法 1.4.1 毛细管电泳法(CE)

毛细管电泳法是近10年来发展较快的一种检测方法, 因其具有分离效率高和经济环保的特点, 已广泛应用于医疗和食品安全检测领域。2008年11月, 饶钦雄等^〔16〕建立了牛奶和奶粉中三聚氰胺的高效毛细管电泳-二极管阵列检测器(HPCE-DAD)测定方法:使用2%三氯乙酸提取, 通过MCX小柱净化, 在以20 mmol/L柠檬酸(Cit)-40 mmol/L Na₂HPO₄作为缓冲溶液(pH 2.6), 分离电压25 kV、进样量3.5 kPa×8s, 检测波长232 nm的条件下, 用二极管阵列检测器进行检测和定量, 牛奶的LOQ为0.5 mg/kg, 奶粉的LOQ为1.0 mg/kg。基于毛细管电泳的分离原理, 其在分析离子化合物方面具有很强的优势, 而且分离效率高, 时间短, 分离模式多种多样。相比于三聚氰胺的HPLC, 它不需要使用昂贵的离子对试剂, 使用的缓冲溶液全是水相, 另外, 也不需要特殊的色谱柱, 仅使用普通的毛细管, 其分析成本较低, 经济环保; 但因毛细管柱内径小(75 μm), 进样量少, 相应的检测窗口比液相色谱的小很多, 所以灵敏度比液相色谱要低。但是这些不足可以采用泡形检测池和使用更高灵敏度的检测器以及柱前浓缩等途径予以弥补。

此法建立的毛细管电泳检测牛奶和奶粉样品中三聚氰胺的方法, 样品前处理简单, 特异性强, 重现性好, 与HPLC分离方法比较, 分析时间相近, 但是经济环保, 适合于大量牛奶和奶粉样品中三聚氰胺的快速初筛检测。

1.4.2 酶联免疫吸附法(ELISA)

目前, 市场已有生产出售三聚氰胺残留检测ELISA试剂盒, 均可定量测定饲料和食品中的三聚氰胺残留量^〔17〕。

陈锡龙等^〔18〕使用美国Beacon公司的三聚氰胺检测试剂盒和北京普朗DNM-9602酶标分析仪, 对饲料中的三聚氰胺进行了测定。结果表明, 当检测量较大时, 可以用酶联免疫吸附法先进行筛选, 这样可以节省时间和工作量, 也有利于降低检测成本。由于此法具有检测限低、检测范围广, 无需昂贵分析仪器和高素质专业分析人员、易于普及的优点, 可以用来进行三聚氰胺检测的筛选。

ELISA法具有操作简便、快速、检测成本低、通量高、对技术人员的要求低, 但精确度较低, 同时还不排除其他类似化合物也会出现同样的检测结果。这种试剂盒可以用于对认为只含有三聚氰胺一种杂质的奶制品的检测。而从国家和食品行业角度的出发, 对三聚氰胺的检测, 必须选择精确度更高的方法, 才能更好地确保结果的真实性。

1.4.3 显色光电比色浊度法

目前市场上销售的便携式三聚氰胺速测仪的检测原理基于显色光电比色浊度法。显色光电比色浊度法是在样品中加入预处理试剂沉淀蛋白质, 取上清液加入适量的显色剂进行反应, 在410 nm处测量溶液的浊度。此法定量检测范围约为10.0~100.0 mg/L, 检出限为2.0 mg/L^〔19〕。显色光电比色浊度法的检测成本低、快速、操作简单, 但检测限较高, 易受基质干扰。

2 展望

HPLC、GC-MS和LC-MS/MS检测方法已被美国FDA采用, 并被我国行业标准、国家标准收录为标准方法。这3种方法的检测优势为检测灵敏度高、重现性好、可靠性高, 其中GC-MS和LC-MS/MS为确认方法。由于GC-MS样品需要衍生, 前处理较为繁琐应用较少; HPLC为主要检测方法, 有条件的实验室已开发LC-MS/MS。这3种方法使用局限性为:操作以及样品预处理较繁锁, 易造成二次污染, 技术产品或仪器设备成本高, 运行费用高。HPLC法的技术发展方向是采用高效色谱柱、高压泵和高灵敏度检测器、柱前或柱后衍生等提高其检测效率、灵敏度、分析速度。LC-MS/MS法的开发方向是改进接口技术, 在高效离子化和离子传输方面进行技术革新来提高其检测灵敏度、准确度、特异性和重现性。CE法是最新建立的检测方法, 其特点是样品前处理简单, 特异性强, 重现性好, 运行成本低, 环保, 适合于大量牛奶和奶粉样品中三聚氰胺的快速初筛检测, 今后的开发方向是通过柱前浓缩和使用更高灵敏度的检测器以及采用泡形检测池等途径进一步提高其检测灵敏度。ELISA、显色光电比色浊度法检测成本低、快速、对技术人员的要求低, 但精确度较低, 同时还会出现假阳性结果, 主要作为快速筛选法使用。

在检测需求上, 目前有必要研究简单、快速、低成本的检测方法应用于日常的生产质量控制中。检测技术及产品主要技术要求^〔20〕为:(1)对三聚氰胺的检测准确, 检测限≤2 mg/kg (L), 重现性好; (2)适合现场、快速检测, 平均每个样品检测时间 < 30 min (包括样品前处理时间); (3)技术产品或仪器设备成本较低, 运行费用低。为普及检测手段, 实现在线质量控制监测, 充分发挥科技在保障食品安全的支撑作用, 为健全食品质量监控体系提供参考方法。