芽胞是产芽胞细菌生长发育到一定阶段, 在一定条件下菌细胞内形成的一个圆形或椭圆形的强折光性小体。芽胞的形成不但受到细菌染色体上芽胞形成相关基因的控制, 同时也受到细菌生活环境中金属离子、温度、分子氧、pH值等因素的影响^〔1〕。酸溶性小分子芽胞蛋白(Small Acid-Soluble Spore Protein, SASP)是芽胞合成过程中产生的特殊物质, 被视为芽胞合成代谢与鉴别芽胞的重要指标^〔2〕。文献报道^〔3-5〕, 细胞壁对细菌的许多生理特性具有重要的影响, 细胞壁缺陷可导致细菌形态结构、代谢活性、致病性、药物敏感性等多种性状发生改变。为进一步探讨细胞壁缺陷对枯草芽胞杆菌形成芽胞以及芽胞代谢的影响, 本研究采用常规细菌学、生理学及分子生物学方法检测枯草芽胞杆菌稳定L型芽胞形成及SASP合成情况。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)(编号63501 -25, 中国药品生物制品检定所); 金黄色葡萄球菌(Staphylococ-cus aureus)(本室保存菌种)。各菌种分别接种于营养琼脂培养基, 置温箱内37 ℃培养18~24 h备用。

1.2 主要试剂与仪器

L型鸡蛋培养基(L-form egg medium, LEM)按文献〔5〕方法配制; 头孢唑林钠注射剂(批号B 03016623, 哈尔滨制药总厂); 芽胞染色液按文献〔6〕方法配制; 多肽分子量标准:分子量2512 -16949 Da (上海华美生物有限公司); 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)按文献〔7〕方法配制; 银染色液按文献〔8〕方法配制; 垂直电泳槽(北京沃德生物医学仪器公司); 冷冻干燥系统(丹麦Heto公司)。

1.3 实验方法 1.3.1 稳定

L型诱导与纯培养物分离将枯草芽胞杆菌涂布接种于LEM平板上, 稀释头孢唑林钠注射剂为5 mg/mL、制备含50 μg/片的滤纸片以诱导L型。取单个L型菌落接种于含头孢唑林滤纸片的LEM上传7代培养后, 接种于不含抗生素的LEM继续传代培养, 共传18代后, 获得稳定L型纯培养物。

1.3.2 稳定

L型的形态与代谢检测取L型纯培养物分别进行革兰染色、细胞壁染色与芽胞染色镜检, 常规细菌学方法检测稳定L型糖发酵等代谢活性。

1.3.3 稳定L型的芽胞及SASP检测

将稳定L型接种于含10^-6mol/LMn²⁺的LEM上置烛缸内37℃温箱培养, 于24, 48, 72, 90h取L型菌落涂片进行芽胞染色镜检, 观察芽胞并计数1000个菌细胞, 以公式(芽胞数量÷观察菌细胞总数)×100%计算产芽胞的百分率。取稳定L型和细菌型的菌落3个, 分别置于5mL灭菌生理盐水内制成菌液。将菌液置100℃水浴加热并在不同时间分别取0.1 mL划线接种于LEM, 置烛缸内37 ℃温箱培养48 h, 观察L型和细菌型的生长情况。收集枯草芽胞杆菌稳定L型纯培养物, 以灭菌生理盐水洗涤3次, 在冷冻干燥仪内于-107 ℃条件下干燥, 按文献〔9〕方法用1 mol/L的HCl与冷冻干燥的枯草芽胞杆菌稳定L型纯培养物混合后静置90 min, 10000 g离心min, 收集上清液, 再经SDS-PAGE检测提取物中的SASP。同样方法作枯草芽胞杆菌芽胞(阳性)及金黄色葡萄球菌(阴性)的对照。

2 结果 2.1 L型的形态与代谢活性(图 1, 2)

枯草芽胞杆菌在含头孢唑林钠的LEM上培养48~72 h后, 低倍镜下可见典型形态的荷包蛋样稳定L型菌落。染色见稳定L型为革兰阳性或阴性, 圆形或卵圆形, 单个、成双或短链状排列, 细胞壁染色阴性, 未发现芽胞样结构。在含Mn²⁺的LEM上, 细菌型最多, 82%菌细胞产生芽胞, 但稳定L型未见形成芽胞。稳定L型可发酵甘露醇, 不分解葡萄糖、麦芽糖、木糖, 触酶阴性。

2.2 L型的芽胞及其代谢(图 3，4)

枯草芽胞杆菌的稳定L型加热3 min后未见菌落生长, 细菌型加热60 min后仍有菌落形成。SDS-PAGE电泳可见枯草芽胞杆菌细菌型形成与SASP分子量一致的蛋白质条带, 葡萄球菌及稳定L型均未发现与SASP分子量一致的蛋白质条带。

3 讨论

细菌芽胞的形成受染色体DNA上多种相关基因的控制, 这些基因的表达可受到不同条件因素的影响与调节。文献报道^〔1〕, Mn²⁺具有促进枯草芽胞杆菌形成芽胞的作用, 葡萄糖、氨基酸代谢产物、嘌呤化合物等则可抑制芽胞基因的表达。本研究结果显示, 丧失细胞壁的枯草芽胞杆菌稳定L型表现为圆形或椭圆形, 单个、成双或短链状排列, 革兰阳性或阴性, 丧失了多种常规细菌学可检测的糖发酵等代谢活性。在培养基内加入Mn²⁺能够促进枯草芽胞杆菌的细菌型高比率地产生典型形态的芽胞, 但其稳定L型菌体在同样条件下并不能形成可见的芽胞。文献报道^〔10〕, 细菌的繁殖体在100℃沸水浴中5 min内可被杀灭, 而芽胞却能够耐受1~2h。本研究结果显示, 枯草芽胞杆菌稳定L型对高温的抵抗力显著低于其亲代细菌型。进一步证实枯草芽胞杆菌的稳定L型不能形成具有正常生理学意义的芽胞, 提示细胞壁缺陷可能通过影响芽胞基因表达或其合成代谢等机制而抑制细菌芽胞的产生。细菌芽胞的形成过程涉及菌细胞的化学组成、形态结构、生理功能等多种生理与生化反应和变化^〔1-2〕。其中一些生化反应是芽胞形成过程中特有的, 导致一些芽胞特异性物质的合成, 使芽胞与繁殖体在化学组成上有很大差异。文献报道^{〔2, 9-11〕}, 酸溶性小分子芽胞蛋白质是存在于芽胞核心的蛋白, 仅在芽胞形成过程中产生, 占芽胞总蛋白量的8%~15%, 成为芽胞合成代谢及其鉴别的重要指标。研究结果显示^〔9〕, 枯草芽胞杆菌芽胞的SASP包括α、β、γ3种, 分子量分别为6940.6, 6849.6和9 137.5Da。本研究通过SDS-PAGE检测, 进一步证实枯草杆菌芽胞具有与SASP分子量一致的条带, 而在不产芽胞的葡萄球菌以及枯草芽胞杆菌的稳定L型均不能检测到SASP。提示细胞壁及其完整性对枯草芽胞杆菌芽胞合成相关的SASP代谢具有重要的影响, 枯草芽胞杆菌稳定L型不能进行SASP的正常合成代谢, 可能是导致细胞壁缺陷枯草芽胞杆菌不能产生芽胞的一个重要的生化机制。