中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (10): 1246-1248   PDF    
引用本文
孙经淞, 靳姗姗, 朴丰源, 洪岩, 曲淑贤, 高船舟, 吕广艳. 染砷小鼠脑突触结构变化及相关基因差异表达[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(10): 1246-1248.
SUN Jing-song, JIN Shan-shan, PIAO Feng-yuan, et al. Changes of synapse and differential expression of relevant genes in cerebrum of mice exposed to arsenic[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(10): 1246-1248.
染砷小鼠脑突触结构变化及相关基因差异表达
孙经淞1, 靳姗姗1, 朴丰源1, 洪岩1, 曲淑贤2, 高船舟2, 吕广艳2     
1. 大连医科大学劳动与环境卫生教研室, 大连 116044;
2. 大连医科大学中心实验室
收稿日期: 2009-01-16
基金项目: 国家自然科学基金(30571584)
作者简介: 孙经淞(1988-), 男, 辽宁人, 本科在读, 研究方向:毒理学。
通讯作者: 朴丰源
摘要: 目的 观察染砷小鼠大脑神经突触结构变化及相关基因表达。 方法 30只昆明种小鼠, 按体重分为3组, 即对照组、1和4 mg/L染砷组, 染毒60 d。应用电镜和基因芯片技术观察砷对小鼠大脑神经突触结构及相关基因表达的影响。 结果 对照组小鼠大脑突触结构清晰, 突触前膜、间隙和后膜特化带清晰, 前突触中可见较多的突触小泡。染砷组小鼠大脑突触前膜、间隙及后膜轮廓清晰, 突触前膜的突触小泡数量明显减少。基因芯片结果显示, 染砷组小鼠大脑突触相关基因差异表达共有10条。上调基因为依赖于钙-钙调蛋白的蛋白激酶IV (Camk4)、速激肽1(Tac1)、多巴胺受体D1A (Drd1a)和多巴胺受体D2(Drd2);表达下调的基因共有6条, 分别为complexin蛋白2(Cplx2)、钙通道α1A亚单位(Cacna1a)、谷氨酸受体互变异构NMDA2B (Grin2b)、亲代谢性谷氨酸受体7(Grm7)、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化2(Als2)和亲代谢性谷氨酸受体2(Grm2)。 结论 亚慢性砷暴露对小鼠大脑突触结构及相关基因表达造成损伤性影响, 提示大脑神经元突触可能是砷神经毒性作用靶部位。
关键词： 三氧化二砷     大脑     突触     差异表达基因     神经毒性    
Changes of synapse and differential expression of relevant genes in cerebrum of mice exposed to arsenic
SUN Jing-song, JIN Shan-shan, PIAO Feng-yuan, et al     
Department of Occupational and Environmental Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, China
Abstract: Objective To examine the influence of subchronic arsenic (As) exposure on synapse ultrastructures and expressions of relevant genes in cerebiwn of mice. Methods Thirty mice were divided into three groups including two experinental groups (1 mg/L or 4mg/L As2O3) and one control As2O3 was given for consecutive 60 days, followed by decollation Changes of synapse ultrastructure and differential expressions of the relevant genes were examined with electron microscope and Gene Chip technique. Results In controls, synaptic vesicle increased obviously within presynapse in cerebrum of the mice.Compared to the controls, synaptic vesicle decreased obviously within presynapse in cerebmm of the mice exposed to As In genechip screening, 10 differential expressions of the relevant genes were observed in experin ental groups Among these genes, Cam k4, Tac1, Drd1a and Drd2 were upregulated and Cp1x2, Cacna1a, Grin2b, Gan 7, AIs2 and Gan2 were down regulated. Conclusion Subchronic exposure to As may affect adversely synapse ultrastructure and expressions of relevant genes in cerebrum of mice.These results indicate that synapse in cerebrum may be a target of As-induced neurotoxicity.
Key words: As2O3     cerebiwn     synapse     differential expression gene     neurotoxicity    

砷是一种重要的环境污染物, 很多国家已受到砷污染的严重危害〔1〕。研究发现, 经染砷后小鼠脑神经细胞出现肿胀, 胞浆和胞核内有空泡变性, 核碎裂〔2〕。实验表明, 染砷组小鼠的记忆功能明显低于对照组〔3〕。提示, 大脑可能是砷神经毒作用的靶器官。大脑具有学习和记忆的重要生理功能, 而在突触前、后膜之间相关神经递质的正常释放、转运以及受体结合是大脑学习记忆功能相关的神经信号传导的重要一环。因此, 如果神经递质的合成以及突触的结构与功能出现异常, 将会严重影响大脑的学习和记忆功能。本研究通过电镜和基因芯片技术观察亚慢性砷暴露对小鼠大脑突触超微结构及相关基因表达的影响, 为探讨砷的神经毒作用机制提供毒理学依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和设备

三氧化二砷(As2O3)(美国Sigma公司); TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司, );RNA纯化试剂盒(RNeasyMiniKit)(德国OIAGEN公司); 焦碳酸二乙酯(DEPC-Water)(美国Ambion公司); 鲱鱼精DNA (Herring Sperm DNA)(美国Promega公司); 牛血清白蛋白(BSA)(美国Invitrogen公司); 3-吗啉丙磺酸(MOPS); β-巯基乙醇(上海Sagon公司); 标准山羊IgG (美国Sigma公司); GeneAr-rayTM扫描仪3000(美国Affymetrix公司); 全自动芯片洗涤工作站450(美国Affymetrix公司); 基因芯片杂交箱640(美国Affymetrix公司); Microarray Suite Version 5.0分析软件(美国Affymetrix公司); JEM-2000EX透射电子显微镜等(日本电子公司)。

1.2 实验动物及处理

健康昆明种小鼠30只, 雌雄各半, 体重(20±2) g。按体重将小鼠随机分为3组, 即生理盐水对照组、低剂量染毒组(As2O3 1mg/L)和高剂量染毒组(As2O3 4mg/L)。小鼠正常饮食, 连续染毒60 d。

1.3 灌注和取材

染毒结束后, 将小鼠用戊巴比妥钠(200 mg/kg)腹腔麻醉, 剪开胸腔, 暴露心脏, 通过左心室及升主动脉插管, 剪开右心房, 先用4℃生理盐水冲洗, 见右房流出液变清, 再灌注4%多聚甲醛溶液(pH 7.4), 待小鼠脑和尾变硬后在冰上取脑, 切取双侧海马成1 mm×l mm×2 mm的组织块, 放入2.5%戊二醛, 2%锇酸后固定, 环氧树脂包埋, 常规染色后进行电镜观察。

1.4 总RNA的提取和基因芯片杂交

染毒结束后, 将小鼠断头处死并立即取脑储存于RNAlazer液中, 低温保存。分别将各实验组(As2O3 1和4 mg/L)和对照组的小鼠大脑和小脑在液氮中进行研磨, 从脑组织中抽提总RNA, 用RNeasy MiniKit进行纯化。提取的RNA在紫外分光光度仪下测定RNA的浓度和纯度, 同时变性胶电泳检测RNA有无降解; 然后反转录成cDNA, 用RNA转录标记试剂盒进行体外转录合成cRNA探针, 合成的同时进行生物素标记; 生物素标记的cRNA探针经片段化处理后与Mouse Genome 430 2.0 Araay基因芯片在杂交箱640中45℃杂交16h, 然后于全自动芯片洗涤工作站450中洗脱、染色; 最后用GeneArrayTM扫描仪3 000扫描杂交信号。

1.5 芯片数据处理和生物学信息分析

杂交结果用Microar-ray Suite Version 5.0软件进行分析。在对单个样本表达分析的前提下, 根据P < 0.04为表达, 0.04~0.06为临界, P > 0.06为不表达, 分别建立对照组、低剂量组, 高剂量组大脑组织的基因表达谱; 然后将二者的基因表达谱进行比较, 根据Signal Log Ratio (SLR)值判断。SLR>1(即表达倍数>2)为表达上调, SLR < -1(即表达倍数 < 2)为表达下调, 筛选得到在对照组、低剂量组, 高剂量组中差异表达的基因探针号输入NetAffy网站(www.affymetrix.com)中进行批量处理查询(Batch Query), 查询出相对应的基因和生物学信息。

2 结果 2.1 砷暴露小鼠大脑组织神经突触结构的变化(图 1~3)
图 1 对照组小鼠大脑突触电镜图(100 000×)

图 2 As2o3 1 mg/L组小鼠大脑突触电镜图(100 000×)

图 3 As203 4 mg/L组小鼠大脑突触电镜图(100 000×)

对照组小鼠大脑神经元的突触结构清晰, 突触前膜、突触间隙和突触后膜特化带清晰, 前突触中可见排列紧密且数量较多的圆形突触小泡。而在染砷组小鼠大脑中, 尽管神经元的突触前膜、突触间隙结构和突触后膜特化带清晰可见, 但前突触中的突触小泡较少, 尤其As2O3 4 mg/L暴露组小鼠大脑神经元的前突触中的突触小泡明显减少。

2.2 砷暴露小鼠大脑突触相关基因的差异表达(表 1, 2)
表 1 染砷组小鼠大脑中差异表达上调的突触相关基因(SLR值)

表 2 染砷组小鼠大脑中差异表达下调的突触相关基因(SLR)

基因芯片筛选结果显示, 与对照组小鼠大脑神经元突触相关基因的表达比较, 亚慢性砷暴露小鼠大脑中差异表达的基因共有10条, 其中上调的基因共有4条, 分别为依赖于钙-钙调蛋白的蛋白激酶IV (Camk4)、速激肽1(Tac1)、多巴胺受体D1A (Drd1a)和多巴胺受体D2(Drd2);表达下调的基因共有6条, 分别为complexin蛋白2(Cplx2)、钙通道α1A亚单位(Cacna1a)、谷氨酸受体互变异构NMDA2B (Grin2b)、亲代谢性谷氨酸受体7(Grm7)、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化2(Als2)和亲代谢性谷氨酸受体2(Grm2)。

3 讨论

研究表明, 砷是一种神经毒物, 染砷小鼠的认知和行为均出现异常表现〔2-4〕。提示, 砷对大脑的学习和记忆功能有一定的抑制作用。在脑中通过各种神经递质进行神经信号传导与人类的学习记忆功能密切相关, 而突触是储存和释放各种神经递质的关键部位。因而突触的结构与功能是否正常是脑组织中各种神经递质能否正常发挥其生理功能的重要前提〔5〕。

本试验对染砷小鼠突触超微结构观察结果显示, 砷可引起大脑神经突触小泡数量明显减少。基因芯片结果显示, 染砷小鼠大脑中与突触相关的差异表达基因共有10条。其中Camk4和Cplx2基因所编码的蛋白与突触功能和突触形成密切相关。Grm7和Grm2所编码蛋白参与突触前膜谷氨酸盐受体功能。Drd1a和Drd2所编码蛋白参与多巴胺受体功能。而这些基因的异常表达, 将影响突触对神经递质的正常释放和结合功能。总之, 亚慢性砷暴露对小鼠大脑神经突触结构及相关基因表达造成损伤性影响, 提示大脑神经元突触可能是砷神经毒性作用的靶部位。

参考文献
[1] Bienert GP, Thorsen M, Schiissler MD, et al. A subgroup of plant aquaporins facilitate the bi-directional diffusion of As (OH)3 and Sb (OH)3 across membranes[J]. BMC Biol, 2008, 6 : 26–40. DOI:10.1186/1741-7007-6-26
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