锰是人体及动植物所必需的微量元素之一, 但摄入过量的锰则会对机体产生不良影响。长期接触锰会对人体的肺脏^〔1-2〕和肝脏^〔3-4〕功能产生损害作用。随着锰的广泛使用, 锰也很快扩散到了环境中^〔5〕。但对于锰的毒性作用机制至今仍不清楚。本实验以血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)活性和组织病理学探讨锰对小鼠的毒性, 分析这2种器官脂质过氧化(LPO)值与锰、钙、锌、铁含量的关系, 并进一步阐明锰的肺和肝脏损害机制, 为锰中毒防治提供基础依据。

电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-OES)等离子发射光谱仪(美国瓦里安公司); Olympus-Au-2700全自动生化分析仪、Olympus-BX-51显微镜(日本Olympus公司); UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津公司); 氯化锰(MnCl₂·4H₂O)(国药集团化学试剂有限公司); 其他试剂均为国产分析纯; 所用试剂均以重蒸水配制。

健康昆明种雄性小鼠, 共30只, 体重25~30 g (江苏大学实验动物中心)。随机分为5组, 每组6只。注射用氯化锰临用前以生理盐水配成MnCl₂/L10g溶液, 染毒组小鼠腹腔注射氯化锰溶液10mL/(kg·bw), 对照组注射生理盐水10mL/(kg·bw)。各组小鼠染毒一定时间后经摘眼球采血, 处死后再迅速取出肺和肝脏, 生理盐水洗净、吸干、称重。血清用于有关生化指标测定, 部分肺和肝脏用于LPO测定, 其余部分经HNO₃-HClO₄湿法消化后, 测定锰、锌、铁等金属的浓度^〔6〕。

各金属浓度测定采用等离子发射光谱法。AST、ALT及LDH活性的测定采用Olympus-Au-2700全自动生化分析仪; L P O测定采用硫代巴比妥酸(T B A)法^〔6〕, 以1, 1, 3, 3 -四乙氧基丙烷(T EP)为标准, 单位以生成丙二醛(MDA)的nmol数表示, 丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

将肺、肝脏组织用福尔马林(10%)固定, 石腊包埋切片, 苏木素-伊红(HE)染色, Olympus-BX -51显微镜光镜下检查, 图像处理采用千屏医学图文分析系统。

采用SPSS 13.0统计软件进行t检验, 结果以x±s表示。

LPO值的影响(表 1)实验结果表明, 染毒MnCl₂ 100 mg/kg, 1次性腹腔注射后, 小鼠肺与肝脏LPO值均有明显的升高, 染毒1 d时LPO指标变化最为明显, 差异有统计学意义(P < 0.05)。

表 1

表 1 染锰不同时间对小鼠肺和肝脏LPO影响[ x±s, μmol/(g·prot))

表 1 染锰不同时间对小鼠肺和肝脏LPO影响[ x±s, μmol/(g·prot))

Mn、Ca、F e、Z n浓度的影响(表 2)实验结果表明, 染锰组小鼠肺、肝中锰含量明显高于对照组, 染毒组肺和肝脏中锰浓度在染毒1 d后均达到峰值, 染毒2 d后肺和肝脏中锰的浓度显著下降, 染毒7 d后各脏器中锰的浓度仍明显高于对照组, 差异有统计学意义(P < 0.05)。染锰组小鼠肺和肝脏中钙的浓度明显高于对照组, 染毒2 d达峰值; 染锰组各脏器中锌和铁的Fe、Zn浓度均明显低于对照组, 染毒4 d后各脏器中锌和铁的浓度仍明显低于对照组, 差异有统计学意义(P < 0.05)。

表 2

表 2 染锰不同时问对小鼠肺、肝脏中Mn、Ca、Fe、Zn浓度的影响(x±s)

表 2 染锰不同时问对小鼠肺、肝脏中Mn、Ca、Fe、Zn浓度的影响(x±s)

表 3

表 3 染锰时间对小鼠血清AST、ALT及LDH活性的影响(x±s, U/L)

表 3 染锰时间对小鼠血清AST、ALT及LDH活性的影响(x±s, U/L)

实验结果表明, 在本实验条件下(染毒剂量MnCl₂/kg 100 mg, 一次腹腔注射)染锰组小鼠的血清AST、ALT及LDH活性均明显高于对照组, 染毒1 d时上述指标变化最为明显, 差异有统计学意义(P < 0.05)。由于是中等剂量急性染毒实验, 随着染毒时间的推移, 部分重金属锰排出了体外(动物排泄实验中已验证), 血清AST、ALT及LDH活性有明显的降低。

图 1

图 1 染锰组24h小鼠肝脏组织光镜结果(HE染色, 10×40)

光镜结果显示, 对照组肝组织形态结构正常, 无明显变性坏死。而小鼠染锰24 h后, 肝组织损伤严重, 出现片状灶性坏死, 淋巴细胞替代肝细胞, 肝细胞水样变性和嗜酸性病变, 部分细胞核呈溶解状。

图 2

图 2 染锰组24h小鼠肺组织光镜结果(HE染色, 10×40)

光镜结果显示, 对照组小鼠肺脏结构正常, 无明显变性、坏死。小鼠染锰(MnCl₂ 100 mg/kg, 腹腔注射) 24 h后, 肺脏组织损伤严重, 肺脏间质内有炎症细胞, 间质增宽, 支气管内可见大量中性白细胞为主的脓性分泌物。

目前普遍认为, 在生物体内适量锰可以对抗自由基氧化作用, 过多则激活细胞色素氧化酶P450的活性, 继而产生自由基, 引起细胞死亡^〔7〕。本实验显示, 小鼠染锰后, 肺、肝脏的LPO值明显高于对照组, 表明锰对肺、肝组织具有损伤作用。染锰小鼠血清AST、ALT、LDH活性明显升高, 提示锰对肺和肝脏组织有损伤作用, 且与染锰小鼠LPO值升高呈正相关。

钙、铁和锌等必需微量元素具有重要的生理作用, 它们在体内的分布与含量往往与许多疾病有关^〔8〕。组织损伤时会引起组织钙浓度升高^〔9-10〕。张志红等^〔11〕认为, 锰可影响钙离子转运机制, 导致细胞内钙离子浓度升高。给动物大量锰时, 组织中锰浓度增加, 锰大量吸收抑制了铁的吸收, 表明锰对铁存在直接的竞争抑制^〔12〕。本研究中染锰后肺和肝脏中钙浓度都有明显升高, 而铁、锌的浓度都有下降, 提示锰过量导致小鼠体内产生的钙、铁、锌等代谢障碍可能是锰致小鼠肺和肝脏毒性的机制之一。