目前治疗艾滋病(AIDS)最有效的方法是高效抗逆转录病毒治疗(HAART)，它能有效抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者体内病毒复制，改善临床症状，延长存活时间。但随着HAART的广泛应用，在药物选择压力下HIV-1出现了交叉耐药和多药耐药^〔1〕。美国和西欧最新研究报道，约10.7%~27.6%的新感染者为HIV-1耐药株感染^〔2-3〕。国外研究证明，耐药变异是导致临床抗病毒治疗失败的主要原因^〔1〕。目前我国部分抗逆转录病毒药物已实现国产化，河南省已大范围开展免费HAART治疗。本研究通过对河南省抗病毒治疗效果进行实验室评估和耐药变异检测，明确我国HIV/AIDS患者抗病毒治疗后耐药变异产生情况及其与免疫学和病毒学指标的关系。

河南省尉氏县和上蔡县已开始高效逆转录(HAART)治疗的HIV/AIDS患者。治疗方案包括D4T/ddI/ NVP和AZT/ddI/NVP。按随机整群抽样原则，选取尉氏县和上蔡县共4个行政村的所有接受HAART治疗的艾滋病患者为研究对象。

分别于2005年6月和2006年12月对300例和266例艾滋病患者进行咨询访谈，在采集流行病学资料的同时进行临床体检并以EDTA-3K抗凝管采集外周静脉血。抗凝血于24 h内测定CD⁴+T淋巴细胞数，抗凝血经常规离心分离血浆，分装后-80℃冻存用于病毒载量和耐药基因变异的测定。

用流式细胞仪(美国BECTONDICKINSON公司)测定CD4⁺、CD8⁺、CD3⁺T淋巴细胞绝对值。将20 μL CD4/CD8/CD3 TRITEST试剂加入CD4绝对计数管中，加入50 μL抗凝血，室温避光15 min；加入免洗溶血素450 μL，室温避光15 min，FACSMULTISET软件检测并进行自动分析。

以200 μL血浆采用标准版模板制备法提取RNA，采用HIV-Monitor 1.5 commercialkit (美国Roche公司)在COBASAMP LICOR自动载量仪上以RTPCR方法测定病毒载量。检测范围为400~750 000拷贝/mL。

(1)病毒RNA提取:以200 μL血浆提取病毒基因组RNA，使用Mag NAPureLC全自动核酸提取仪，按仪器操作说明进行，纯化RNA溶于100 μL洗脱液中。(2) RNA逆转录PCR和套式PCR:RNA逆转录PCR反应体系: 0.5 μL特异性下游引物RT-21(Ctg TAT TTc Tgc TAT TAA gTc TTT TgA Tgg g)(50 pmol/μL)，MgCl₂ 2 μL (25 mmol/L)，10 ×RNA PCR Buffer 1 μL (100 mm Tris-HClpH 8.3，500 mm KCl)，dNTP混合物1 μL (10 mm)，AMV逆转录酶XL 0.5 μL (5U/μL)，RNA酶抑制剂0.25 μL (40U/μL)，无RNA酶去离子水1.5 μL，4 μL提取的RNA模板，反应体积为10 μL，反应条件为: 30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，一个循环。(3)套式PCR:外侧引物反应体系:外侧引物MAW-26(TTg gAA ATg Tgg AAA ggA Agg Ac)、RT-21各3.125 μ L (10 pmol/μL)，10×PCR Buffer 2.5 μL (100 mmol/L Tris-HClpH 8.3，500 mmol/L KCl)，TaKaRa Taq酶0.125 μL (5 U/μL)，高压去离子水14.25 μL；5 μL提取的RNA，反应体积为25 μL。反应条件: 94 ℃ 5 min，1个循环，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。内侧引物反应体系:内侧引物PRO-1(cAg Agc cAA cAg ccc cAc cA)、RT-20(cTg ccA gTT cTA gcT cTg cTT c)各12.5 μL (10 pmol/μL)，10 × Buffer 5 μL (100 pmol/μ LTris-HClpH 8.3，500 pmol/μL KC l，Mg²⁺ 25 mm)，TaKaRa Taq酶0.25 μL (5 U/μL)，高压去离子水31.75 μL，dNTP混合物1 μL (10 pmol/μL)，反应体积为50 μL。反应条件: 94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。QI Aquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化套式PCR产物。(4)核苷酸序列测定及分析:使用AB I377全自动DNA测序仪，按操作说明应用双脱氧终止法测定HIV-1RNA pol区部分基因序列(蛋白酶1-99密码子和逆转录酶1-220密码子)。测序引物: PRO-1和RTA (GTTGACTCAGATTGGTTGCAC)，RT-B (TTA AAg CCA ggA ATg gAT gg)。contig软件处理原始核苷酸序列，参照测序谱图进行基因序列修订后，转换为氨基酸序列，将序列与Stanford HIV Drug Resistance Database中的参考株序列进行比较，分析耐药变异的位置和种类。

表 1

表 1 不同治疗时间病毒抑制情况( x±s)

表 1 不同治疗时间病毒抑制情况( x±s)

2006年与2005年比较，病毒抑制情况差异无统计学意义(P > 0.05)。2.2维持和提升CD⁴⁺T淋巴细胞的效果(表 2) 2006年与2005比较，CD⁴⁺T淋巴细胞差异无统计学意义(P > 0.05)。

表 2

表 2 不同治疗时间CD4+T淋巴细胞变化情况

表 2 不同治疗时间CD4+T淋巴细胞变化情况

表 3

表 3 不同治疗时间病人耐药相关突变率

表 3 不同治疗时间病人耐药相关突变率

2006年与2005年比较，耐药突变率差异无统计学意义(P > 0.05)。

本研究检测了抗病毒治疗开始后第1年和第3年时河南省尉氏和上蔡2个县的治疗效果和耐药情况。结果显示: 2种主要治疗方案D4T/ddI/NVP和AZT/ddI/NVP都在50%左右的AIDS患者身上取得病毒抑制效果，并且随着治疗时间的延长，其病毒抑制效果并未减弱。并且80%以上的病人在治疗近3年时CD⁴⁺T淋巴细胞仍维持在200 mL以上，表明我国HIV/AIDS患者总体上对HAART治疗病毒学反应良好，持续用药可以保持较好的病毒抑制和CD⁴⁺T淋巴细胞水平。

2005年2个县总耐药突变率为17.7%，绝大部分为高度耐药，随着治疗时间的延长，到2006年底总耐药率上升为19.5%，仍以高度耐药为主，且以非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)耐药为主，与2005年比较无明显变化(P > 0.05)。在治疗近3年后耐药率仍低于20%，该耐药率远低于同样治疗时间的欧美艾滋病患者^〔2-3〕。表明河南省HIV/AIDS患者应用HAART治疗基本上取得了预期的疗效，但在应用NNRTI治疗后耐药变异发生频率很高，且这些变异常引起交叉耐药，使尚未应用的药物失效，在我国目前抗病毒治疗药物品种有限的情况值得关注。应用核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)治疗后引起部分HIV/AIDS患者出现耐药变异但发生率明显低于NNRTI的耐药变异。提示在应用NNRTI时一定要加强监测，及时调整用药、规范化治疗和管理，节省有限的药物资源并防止耐药株的产生^〔4-5〕。