2009, Vol. 25
细胞色素P4501A1(CYP1A1)主要参与内外源物质的生物转化, 包括药物、前致癌物等。大多数化学致癌物质需经过代谢激活后才能产生毒性, 导致癌症。癌前物质的激活与CYP1A1酶活性密切相关。其酶活性有种族差异, 不同的个体间相差可达50倍〔1-2〕。谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)是细胞内重要的代谢酶, 其中GSTM1负责对苯并芘代谢的活性产物-环氧或羟化物的解毒, GSTM1基因缺陷型个体缺乏GSTM1酶活性, 失去了解毒功能, 增加个体患癌的危险性〔3〕。为了解CYP1A1和GSTM1在贵州省苗族人群中的分布, 提高对肿瘤易感者的预测水平, 于2005-2007年以贵州苗族人群为研究对象, 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction restriction fragment length polyorphism, PCR-RFLP)技术, 对CYP1A1、GSTM1基因多态性进行研究。
1 对象与方法 1.1 对象于2005年随机抽取贵州省黔南布依族苗族自治州惠水县97名无亲缘关系的健康苗族人, 其中男性56人, 女性41人; 年龄16~70岁。
1.2 方法 1.2.1 DNA提取取用乙二胺四乙酸钾(EDTA-K2)抗凝的新鲜全血2 mL, 采用经改良的酚/氯仿抽提法提取DNA, 并用紫外分光光度法测定A260和A280比值, 若比值在1.70~1.90之间说明提取DNA纯度符合要求。DNA用100 μL三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液溶解后, 4℃下备用。
1.2.2 CYP1A1基因分型检测〔4〕(1)引物:引物序列为上游5′-CAGTGAAGATGTAGCCGCT-3′和下游5′-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3′, 引物由上海生工生物工程公司合成。(2) PCR扩增及限制性酶切反应:操作步骤参照文献〔4〕。
1.3 GSTM1基因分型检测〔5〕(1)引物:GSTM1基因引物序列为:上游5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′, 下游5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′; 内对照β珠蛋白基因(β-globin)引物序列为:上游5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′和下游5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′, 均由上海生工生物工程公司合成。(2) PCR扩增反应总体积为50 μL, 反应条件参照文献〔5〕。电泳结果均在Gel Voc2000凝胶成像分析系统仪(美国Bio Rad公司)上进行观察和分析。
2 结果 2.1 CYP1A1基因分型(图 1)
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注：1，3：野生型；2，4：突变纯合型；5：杂合型；M：DNA分子量标准。 图 1 CYP1A1基因的电泳条带 |
在CYP1A1基因的3′非编码区腺苷酸下游264 bp处, 由胸腺嘧啶T突变为胞嘧啶C, 并形成MspⅠ酶切点, 产生MspⅠ多态性CYP1A1 ml。其多态性有3种基因型:野TT); 杂合型(TC)和突变纯合型(CC)。PCR扩增产物经MspⅠ酶切后, 野生型为340 bp, 突变型为200和140 bp2个片段, 杂合型为340, 200, 140 bp 3个片段。结果显示, 97人中野生型、杂合型、突变型分别为69, 18, 10人, 分别占71.13%, 18.56%, 10.31%;野生型和突变型等位基因频率分别为0.805和0.195。
2.2 GSTM1基因分型(图 2)
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注：1：缺陷型；2，3：正常型；M：DNA分子量标准。 图 2 GSTM1基因电泳条带 |
GSTM1基因的PCR扩增产物分为2个基因型, 凡GSTM1基因非缺陷型标本均可同时扩增出268和215 bp2个DNA片段; 而GSTM1基因缺陷型标本扩增268 bp片段, 无215 bp特异DNA片段。本次调查的97人中有67人为GSTM1基因缺陷型, 其基因频率为69%。
3 讨论CYP1A1定位于染色体15q22-q14, 编码芳烃羟化酶(AHH), CYP1A1多态性有4种:MspⅠ多态性、异亮氨酸(Ile)/缬氨酸(Val)多态性、AA多态性和外显子的4887位点多态性。有资料表明, MspⅠ多态性与CYP1A1酶活性增强有关, 因而其该突变与多种肿瘤易感性相关〔6-7〕。不同种族人群中CYP1A1的遗传多态性明显不同, 在所有研究中, CYP1A1MspⅠ多态性(TC, CC)范围在15%~33%〔8〕。本研究中, CYP1A1MspⅠ多态性的等位基因频率为0.195, 经u检验发现, 明显低于中国汉族人〔9〕、日本人〔10〕和韩国人〔11〕 (等位基因频率分别为0.424, 0.370和0.355), 而高于德国人〔12〕和荷兰人〔13〕(等位基因频率分别为0.056和0.085)。谷胱甘肽硫转移酶是体内一种多功能酶, 对外源性化合物具有解毒作用, 因此, 该酶的缺陷对肿瘤形成过程具有一定的影响〔14〕。人类谷胱甘肽硫转移酶基因是一个超基因有族, 该家族分为α、μ、π、θ、δ、κ等8型〔15〕。GSTM1基因是其中的一个亚型。GSTM1在人数中存在表型差异, 其缺陷型(null genotype)使GSTM1酶活性缺失。研究表明, GSTM1基因缺陷率在不同种族人群中有明显差异, 约在40%~73%之间〔8〕。本研究显示, 贵州省苗族人群GSTM1基因缺陷率达67%, 经u检验发现, 与中国汉族人〔9〕(基因缺失率为55.4%)比较无明显差异, 而明显高于日本人〔16〕、韩国人〔11〕、德国人〔17〕和波兰人〔18〕(基因缺失率分别为42%, 53.3%, 44%和47%)
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