海南省自1991年发现首例人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者以来，已蔓延至全省13个市县，为了解感染者之间的传播模式，于2007年5月采集全省13个市县的88例HIV感染者的血液标本进行HIV基因系列分析，以了解HIV毒株亚型分布及基因变异情况，为艾滋病(AIDS)预防和控制提供科学依据。现将结果报告如下。

标本来源于2007年海南省有艾滋病疫情的市县采集艾滋病病毒感染者和病人(HIV/AIDS)96份血液样品，其中88份为HIV阳性者标本，8份为阳性者配偶的阴性标本。其中男性72例，女性16例，平均年龄31岁，静脉吸毒56例，性传播19例，本省户籍84例，外省户籍4例。

从血浆中提取病毒RNA；逆转录病毒的RNA的聚合酶(pol)和膜糖蛋白基因(env)片断；巢式PCR扩增env V3~V5片断，目的片段大小为660 bp；巢式PCR扩增pol片断，覆盖HIV-1蛋白酶和逆转录酶的编码区，目的片段大小为1860 bp。

pol片段大小约为1860 bp，采用分6个引物分别测序，再使用DNAStar Lasergene 7.1的Se-qMan软件拼接得到目的片段。引物如下: AV150: 5′-GTGGAA AGG AAG GAC ACC AAA TGA AAG-3′；POLM1bis: 5′-CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3′；POLM2bis: 5′-CAC AGG GAT GGA AAG GAT CACC-3′；POLM8: 5′-CTG TAT ATC ATT GAC AGT CCA G-3′；POLM9: 5′-ATT GAA CTT CCC AGA AGT CTT GAG TT-3′；POLM4: 5′-CTA TTA GCT GCC CCA TCT ACATA-3′。

env片段大小约为660 bp，采用正反引物双向测序，再拼接的方法得到目的片段。引物如下: ES7 (正向) : 5′-CTC AAC TGC TGT TAA ATG GCA GTC TAGC-3′；ES8 (反向) : 5′-TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCCCTC A-3′。

使用Blast程序将测序所得结果与GenBank中的序列进行比较，检查在实验过程中是否有交叉污染；在Genebank (NCBI)或HIV Database (Los Alamos)中检索所有独立的HIV-1亚型的基因型(A1，A2，B，B'，C，D，F1，F2，G，H，J，K，L)，以及相关的重组基因型(CRF01-AE, CRF02 _ AG, CRF07_BC, CRF08 _BC, CRF13 _cpx, CRF15_01B, CRF33_ 01B, CRF34_01B)的核酸序列；使用ClustalX 1.83对所有正确的序列以及在基因库中检索出来的序列共同进行比对。根据最大似然法(ML)的计算结果，判断分析在所有HIV-1阳性感染者之间有无传播链的存在。判断标准为pol基因序列的计算结果支持率 > 98%，分支长度 < 0.015。

经pol基因及env基因序列比对分析，88份样品中有83份样品可确定分为6种HIV-1亚型或重组亚型，另外5份样品未能扩增出全部pol基因和env基因片段，无法明确分型。除五指山市外，全部有艾滋病疫情的采样点市县均有CRF01-AE亚型存在，3个市县有2种亚型，2个市县有3种亚型。

表 1

表 1 83份样品中HIV-1亚型在不同感染途径的人群中分布

表 1 83份样品中HIV-1亚型在不同感染途径的人群中分布

83份样品的感染途径分为静脉吸毒、性传播和经血液制品3类。静脉吸毒人群感染的HIV-1亚型全部为CRF01-AE亚型，未发现其他亚型。经性传播感染的人群亚型复杂多样，包括检出的全部亚型。

将所获得的83份样品基因序列与各亚型地区或国际参考株pol基因序列构建系统进化树。在83个样品中，有66个样品(79.5%)分属于4个大小不同的传播群(transmission clusters)，它们都是根据最大似然法的计算结果(bootstrap值是在重复1 000次基础上得到)，以计算结果支持率(bootstrap values) > 98%，平均分支长度(average branch lengths)即遗传距离(mean genetic distance) < 0.015为判断标准。传播群1最大，有59例，形成了一个庞大的传播群；传播群2有3人，传播群3和4各有2人。非传播群有17个样品(20.5%)。传播群1有53人为静脉吸毒人群，有6人为经异性性传播，其中有4人为吸毒者的配偶。传播群2均为吸毒人员。传播群3，其性传播感染可能性较大。传播群4为异性性传播感染。非传播群的样品除1例为经血制品感染HIV外，其他均为性传播途径感染。

将所获得的83份样品基因序列与各亚型地区或国际参考株env基因序列构建系统进化树。pol序列的所有传播群在env序列都有体现，但其分支长度(遗传距离)均较pol序列的传播群长，均值都 > 0.015。在分析pol序列得到的4个传播群当中，传播群2，3，4的个体没有变化，且传播群2，4的bootstrap值仍然 > 98%，而传播群3的bootstrap值较低 < 90%；传播群1由原来的59人增加到61人，bootstrap值仍然 > 98%。

本次研究结果表明，海南省居首位的HIV亚型为CRF-AE亚型(84.33%，70/83)，同时，新发现1例CRF01-AE/B′重组亚型。从HIV-1亚型的地域分布来看，不同亚型在呈不平衡分布，CRF01-AE亚型HIV-1流行区域最广，除五指山市外见于所有调查市县，其次为B′亚型。在海南省西南地区(三亚市21例、乐东县13例、东方市12例和儋州市11例) CRF01-AE亚型占绝对优势，占全部被调查市县的68.6%。吸毒者的CRF01-AE亚型分布在西南地区和沿海的万宁市与临高县。经性传播的亚型散在分布在北部各市县，呈现出从北部向中部山区和全省范围蔓延扩散的趋势。

本次研究结果表明，海南省吸毒人群均为CRF01-AE重组亚型(100%)，未发现其他亚型。其不同于国内其他省份的CRF-BC亚型的原因，可能CRF-BC亚型在海南省的流行还处于较低水平(1例)，其向吸毒人群扩散慢于其他亚型；也可能与亚型的先期基础效应有关^〔1〕，CRF01-AE进入吸毒人群后就快速传播开来。经性传播人群的亚型呈多样性，包括检出的全部亚型，与内陆经性传播亚型呈多样性的特点相似。对于病毒

基因序列系统发育分析的方法最近已被用来分析各地急、慢性HIV-1感染人群内直接或间接的传播链^〔2-6〕。发现这一方法能够在分子水平追踪HIV-1的传播链。本研究ML进化树显示，近80%(66/83)感染者可确定其流行病学关系，对于传播群1，其感染HIV的来源很可能是1~2人，然后通过共用针头静脉吸毒的方式逐渐扩散开，形成了一个奠基者效应(Founder Effect)。在进化树上他们关系很近共同形成了一个很密集的分支群。同样，也表明传播群1、传播群2和非传播群的CRF01-AE亚型的进化差异，非传播群的CRF01-AE亚型有8人，均为异性性传播感染HIV，与传播群2以及福建省和广西壮族自治区已知的毒株的基因距离更为接近，而与传播群1距离较远。表明海南省的CRF01-AE毒株大体上来源于2个途径，最主要的是静脉吸毒以及吸毒者相关的性传播，其次还有少量的CRF01-AE来源于性传播，这个性传播很可能是CRF01-AE从邻近的省份扩散而来。