中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (9): 1129-1131   PDF    
引用本文
肖瑛, 石明隽, 桂华珍, 郭兵, 张国忠. 依那普利对糖尿病大鼠肾小管BMP-7表达影响[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(9): 1129-1131.
XIAO Ying, SHI Ming-juan, GUI Hua-zhen, et al. Effect of enalapril on expression of bone morphogenetic protein-7(BMP-Ⅰ) in renal tubules of diabetic rat[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(9): 1129-1131.
依那普利对糖尿病大鼠肾小管BMP-7表达影响
肖瑛, 石明隽, 桂华珍, 郭兵, 张国忠     
贵阳医学院病理生理学教研室, 贵州 贵阳 550004
收稿日期: 2009-04-08
基金项目: 教育部博士学科专项基金(20060660001);贵州省优秀科技教育人才省长专项基金(2005-303)
作者简介: 肖瑛(1977-), 女, 湖南邵阳人, 讲师, 博士在读, 研究方向:糖尿病肾病发病机制。
摘要: 目的 探讨依那普利治疗糖尿病(DM)肾病作用机制. 方法 SD大鼠分为正常对照组、糖尿病组和依那普利治疗组.以链脲佐菌素复制DM模型.12周后测定血糖、血肌酐和24 h尿蛋白及肾脏指数; 免疫组化检测肾小管上皮细胞骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、蛋白激酶Cα(PKCα)、血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)和结缔组织生长因子(CTGF)表达; RT-PCR方法检测肾皮质相应指标基因的水平. 结果 与正常对照组比较, 糖尿病组肾小管PKCα蛋白及mRNA, ANGⅡ、CTGF和FN蛋白表达分别增多了94.3%及62.2%, 86.2%, 93.6%和90.8%(P < 0.05);而BMP-7蛋白及mRNA表达减少了21%及59.7%(P < 0.05).依那普利治疗组除血糖外较糖尿病组降低了31.6%及41.3%, 40.2%, 54.7%和24%(P < 0.05);而BMP-7表达增加了21.1%, 15.3%(P < 0.05);依那普利治疗组BMP-7与PKCα、ANGⅡ、CTGF和FN表达呈负相关(r=-0.838, -0.885, -0.829和-0.931, P < 0.05或P < 0.01). 结论 依那普利可部分抑制ANGⅡ生成, 并通过PKCα和CTGF抑制BMP-7的表达从而改善糖尿病肾病.
关键词： 糖尿病     骨形态发生蛋白-7     蛋白激酶Cα     依那普利    
Effect of enalapril on expression of bone morphogenetic protein-7(BMP-Ⅰ) in renal tubules of diabetic rat
XIAO Ying, SHI Ming-juan, GUI Hua-zhen, et al     
Department of Pathophysiology, Guiyang Medical College, Guizhou 550004, China
Abstract: Objective To investigate the regulatory mechanism of enalapril to BMP-7 in diabetic nephropathy. Methods SD rats were divided into control group and model group.The diabetes model was established by injecting STZ through vena caudalis, and the rats in the model group were divided randomly into diabetic group (DG) and diabetic enalapril-treated group (DEG).After 12 weeks, blood glucose, creatinine and 24 hours urineprotein were analyzed with biochemical methods.Kidney index was calculated.Immunohistochemistry was employed to detect expressions of BMP-7, PKCα, ANGⅡ, CTGF and FN protein in renal tubules of all groups.The mRNA levels of BMP-7 and PKCα in renal cortex were examined by RT-PCR. Results Compared to control guoup, the expressions of PKCα protein and mRNA, ANGⅡ, CTGF and FN protein in renal tubular cells were increased remarkably to 94.3%, 62.2%, 86.2%, 93.6%, and 90.8% in DG group.On the other hand, the protein and mRNA of BMP-7 decreased remarkably to 21% and 59.7% in DG.In DEG group, the expression of PKCα protein, PKCα mRNA, ANGⅡ, and FN protein was down-regutated to 31.6%, 41.3%, 40.2%, 54.7%, and 24%, respectively compared with that of DG; but the protein and mRNA of BMP-7 were up-regulated notably to 21.1% and 15.3%.The expression of BMP-7 protein was negatively correlated with PKCα, ANGⅡ, CTGF and FN in DEG (r=-0.838, -0.885, -0.829, and-0.931, P < 0.05 or P < 0.01). Conclusion Enalapril can diminish renal ANGⅡ level and up-regulatie PKCα and CTGF expression, then inhibit the expression of BMP-7 and therefore improve the damage in diabetic nephropathy.
Key words: diabetes     BMP-7     PKCα     enalapril    

骨形态发生蛋白-7(BMP-7)能拮抗转化生长因子-β1(TGF-β1)作用而延缓肾小管间质纤维化〔1〕。多种信号途径〔2-4〕如蛋白激酶Cα(PKCα)可增加糖尿病(DM)肾组织TGF-β1及结缔组织生长因子(CTGF)的表达, 参与糖尿病肾病(DN)的发生发展; 给予依那普利阻断血管紧张素Ⅱ (ANGⅡ)可降低DM肾小管PKCα的活性, 减少细胞外基质沉积而延缓DN肾小管间质损害。有研究发现〔5〕, 依那普利可促进DM大鼠肾脏表达BMP-7。为探讨依那普利促进内源性BMP-7表达上调与其阻断PKCα和ANGⅡ的表达关系进行了本研究。

1 材料与方法 1.1 试剂

依那普利(江苏扬子江制药厂); 链脲佐菌素(STZ, 美国Sigma公司); 山羊抗大鼠BMP-7多克隆抗体(美国Santa cruz公司); 兔抗大鼠PKCα、ANGⅡ、CTGF和纤维连接蛋白(FN)多克隆抗体和生物素化山羊抗兔IgG (武汉博士德公司); UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒(KIT-9709/9719, 批号: 707189709)和DAB显色试剂盒(批号: 705150031, 福州迈新公司); 二步法免疫组化检测试剂(PV-6001);二甲基氨基偶氧苯浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9032)(批号: K72331B, 北京中杉公司); Taq PCR Master Mix、D2000(北京天根生化科技有限公司); 逆转录(RT)试剂盒(美国Fermentas公司); 血糖、血肌酐和尿蛋白检测试剂盒(四川迈克公司); Glucometer 4型血糖仪(美国Baer公司)。

1.2 糖尿病模型的制备、分组及药物剂量

雄性SD大鼠18只, 体重174~204 g (上海西普尔-必凯实验动物有限公司)许可证号: SCXK (沪)2003-0002。随机选取6只大鼠作为正常对照组, 于尾静脉注射0.01 mol/L的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)。其余大鼠尾静脉注射溶于0.01 mol/L的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的STZ (pH 4.5), 剂量为50 mg/kg。注射后48 h尾静脉采血测血糖, 凡血糖值≥16.7 mmol/L大鼠作为糖尿病大鼠〔6〕。将糖尿病大鼠随机分为2组, 每组6只, 糖尿病组和依那普利治疗组。治疗组灌胃给予依那普利10 mg/(kg·dw), 连续12周。大鼠喂以普通饲料, 自由饮水。

1.3 检测方法 1.3.1 血、尿及肾组织采集

大鼠处死前代谢笼收集24 h尿; 心脏穿刺采血; 肾脏经充分灌洗后, 称重, 一侧肾脏置-80 ℃冰箱保存供RT-PCR检测用, 另一侧肾脏用4%多聚甲醛固定, 供石蜡切片用。

1.3.2 免疫组织化学

3 μm厚肾组织石蜡切片, 微波修复抗原, 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测BMP-7、PKCα、ANGⅡ和链酶亲和素-过氧化物复合物(SABC)法测CTGF、FN, 以PBS作阴性对照, DAB染色。在高倍镜(400倍)下计数肾皮质10个不重复视野的BMP-7、PKCα、ANGⅡ和CTGF染色阳性肾小管数, 取均值; FN在显微镜测微尺(0.5网形目镜尺)下计数十字交叉点与FN阳性染色重合的点数, 计数10个视野(400倍), 取均值。

1.3.3 RT-PCR

用Trizol试剂提取肾皮质总RNA, 1 μg总R NA按逆转录试剂盒方法进行RT-PCR检测。引物自行设计, 委托上海Generay Biotech公司合成。BMP-7产物长度451 bp, PKCα产物长度100 bp, β-actin产物长度490 bp。PCR反应参数根据各不同目的片段进行最优化。PCR反应条件: 94 ℃预变性2 min, 94 ℃变性30 s, 退火30 s (BMP-7温度为57.5 ℃, PKCα温度为54.3 ℃), 72 ℃延伸30 s, 40个循环后充分延伸10 min。最后将扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳, 应用凝胶成像系统进行扫描并用ChmioDox软件分析图像, PCR产物量以吸光度×面积表示, 与β-actin比值表示目的基因的相对含量。

1.3.4 其他指标检测

氧化酶法测血糖, 终点法测血肌酐, 考马斯亮蓝法测尿蛋白, 按试剂盒说明书操作。

1.4 统计分析

采用SPSS11.5软件进行分析, 组间数据比较采用单因素方差分析; 用Pearson's方法进行相关分析。

2 结果 2.1 各组生化指标变化(表 1)
表 1 各组血糖、血肌酐、24 h尿蛋白和肾脏指数比较(x±s)

糖尿病组的血糖、血肌酐及肾脏指数均明显高于正常对照组, 出现明显的尿蛋白; 依那普利治疗组与糖尿病组比较, 血肌酐和24 h尿蛋白量均明显下降, 肾脏指数相对减小。

2.2 免疫组化结果(表 2)
表 2 各组BMP-7、PK、ANGⅡ、CTGF和FN蛋白的表达(x±s)

正常对照组BMP-7高表达于集合管和肾小管胞浆, 肾间质及肾血管外膜也有少量表达, 但肾小球未见阳性表达; 肾小管上皮细胞胞浆靠管腔侧有少量PKCα、ANGⅡ和CTGF的表达; FN沿肾小管基膜呈线性分布。糖尿病组BMP-7表达明显低于正常对照组; 同时肾小管上皮细胞PKCα、ANGⅡ和CTGF明显增多, FN表达也明显增多。依那普利治疗组肾小管BMP-7的表达高于糖尿病组, 与正常对照组比较差异无统计学意义; PKCα、ANGⅡ和CTGF表达比糖尿病组显著减少, 但3者表达仍高于正常对照组, 同时FN的表达也明显低于糖尿病组。

2.3 RT-P C R结果(图 1)
注：M：Marker；1：正常对照组；2：糖尿病组；3：依那普利治疗组。 图 1 RT -PCR示各组大鼠肾皮质中BMP-7和PKCom~RNA水平

正常对照组肾皮质BMP-7 mRNA呈强表达, PKCαmRNA有少量表达; 糖尿病组BMP-7 mRNA表达明显减少, 同时PKCαmRNA的表达明显增多; 与糖尿病组比较, 依那普利治疗组BMP-7 mRNA表达表显上调, 而PKCαmRNA的表达明显降低。

2.4 相关性分析

糖尿病组BMP-7蛋白分别与PKCα、ANGⅡ、CTGF、FN蛋白呈显著负相关(r=-0.992, -0.997, -0.539和-0.977, P < 0.01); ANGⅡ蛋白与CTGF、FN呈明显著正相关(r=0.602, P < 0.05和0.975, P < 0.01)。依那普利治疗组BMP-7蛋白分别与PKCα、ANGⅡ、CTGF、FN蛋白也同样呈显著负相关(r=-0.838, -0.885, -0.829, P < 0. 05和-0.931, P < 0.01); ANGⅡ蛋白与CTGF、FN呈显著正相关(r=0.829和0.886, P < 0.05)。

3 讨论

研究发现〔7-9〕, DM大鼠肾小管BMP-7表达与肾脏病变相关联, 而给予依那普利可上调内源性BMP-7表达。但是, 依那普利调节DM大鼠肾小管BMP-7的作用机制尚不清楚。本研究观察到, 糖尿病组大鼠肾小管BMP-7 mRNA和蛋白减少, 尤其mRNA减少更明显, 而ANGⅡ表达增多, 并且2者呈显著负相关。依那普利治疗则使肾小管ANGⅡ表达减少约40%, 而BMP-7 mRNA和蛋白表达增加, 提示依那普利可能通过抑制ANGⅡ的生成而上调BMP-7 mRNA和蛋白的表达。

DM时肾小管表达PKCα增多, 高糖和AngⅡ对PKCα激活有协同作用; 使用ANGⅡ受体(AT1)阻断剂可以减少PKCα表达〔4, 10-11〕。研究表明, 给正常大鼠注射ANGⅡ可显著上调肾小管CTGF的表达〔12〕; CTGF可以抑制BMP-7的下游Smad1/5信号通路而抑制BMP-7对肾脏的保护作用〔13〕。本研究显示, 糖尿病组大鼠肾小管PKCα蛋白和mRNA表达增多, 并且与ANGⅡ表达增多相一致, 糖尿病组和依那普利治疗组大鼠肾小管ANGⅡ蛋白与CTGF和肾小管间质FN蛋白呈显著正相关, 并且FN蛋白与BMP-7呈负相关, 提示依那普利可能通过抑制ANGⅡ的生成, 减少PKCα表达从而减弱CTGF对BMP-7下游信号的抑制作用, 使FN的沉积减少和改善肾功能。

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