微核是细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时, 仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片, 这种情况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果^〔1〕。骨髓细胞微核数增高是全身一次性γ射线照射引起染色体损伤的主要表现之一, 在一定范围内, 骨髓细胞微核率与照射剂量成正比与恢复时间呈反比^〔2〕。因此, 骨髓细胞微核率的变化常常作为判定辐射损伤的程度以及评价辐射损伤保护作用重要指标^〔3-4〕。本研究采用不同剂量γ射线照射小鼠, 不同时间采集骨髓, 观察微核细胞率的变化, 以期探讨剂量与时间反应关系, 为相关实验提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

选用清洁级昆明种小鼠80只(上海斯莱克实验动物有限责任公司), 雄性, 体重18~22 g; 实验动物生产许可证号为SCXK (沪) 2003-0003。无菌块状鼠料(沈阳市于洪区动物实验饲料厂)实验动物生产许可证号为SCXK (辽) 2003-0011号。

1.2 动物实验设施

屏障系统动物实验室, 温度(22±1.5) ℃, 湿度(50±10)%, 工作照度160~280 1x, 噪音 < 60 dB; 实验动物使用许可证号为SYXK (辽) 2007-0014号。

1.3 实验方法

取30只小鼠随机分为3组, 每组10只, 用3 Gy γ射线全身照射1次, 分别于照射后1, 2和3 d处死小鼠取材制片; 另取50只小鼠随机分为5组, 每组10只, 除第1组未照射(0 Gy)外, 其余各组分别用1~4 Gy剂量水平γ射线全身照射1次。照射后第2 d, 颈椎脱臼处死动物, 取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片, 甲醇固定, 吉姆萨(Giemsa)染色。用生物显微镜镜检, 每只动物计数1 000个嗜多染红细胞(PCE), 微核发生率以含微核的嗜多染红细胞‰计。计数200个嗜多染红细胞中成熟红细胞(NCE), 计算PCE/NCE比值。

1.4 统计分析

采用SPSS11.5软件中的单因素方差分析对嗜多染红细胞与成熟红细胞比值进行统计分析。各组间骨髓细胞微核率比较采用χ²检验。

2 结果 2.1 骨髓细胞微核率及PCE/NCE比值时间变化(图 1)

照射后第1, 2, 3 d的骨髓细胞微核率分别为41.8‰, 32.7‰, 3. 3‰, 差异有统计学意义(χ²=159.25, P < 0.01)。PCE/NCE比值同样随时间呈下降趋势, 照射后1, 2, 3 d分别为0.2, 0.031和0.017, 差异有统计学意义(F=110.73, P < 0.01)。

2.2 PCE/NCE比值与照射剂量关系

未照射组(0 Gy)嗜多染红细胞与成熟红细胞比值为(1.35±0.12), 随着照射剂量不断增加, 比值迅速下降, 当照射剂量达4 Gy时, 该比值降至(0.006±0.006)(F=114.64, P < 0.01), 呈指数曲线下降。拟合方程为y=1.781 5e^{-1.349 6x}, R²=0.971 2, 理论半衰剂量为1.349 6 Gy

2.3 骨髓细胞微核率与照射剂量关系

骨髓嗜多染红细胞微核率随着照射剂量逐渐增加先上升而后下降, 未照射(0 Gy)组微核率仅为2‰, 1~3 Gy照射后分别升为3.8‰, 1.9‰和32.7‰。当照射剂量继续增至4 Gy时, 微核率急剧下降至0.2‰(χ²=362.024, P < 0.01)。曲线拟合以多项式函数相关系数最大。方程: y=3.034 3-4.966 7x³ +25.807x² -24.212x。(R=0.895 6)。

3 讨论

骨髓中嗜多染红细胞占红细胞总数的比值或一定数量的红细胞中嗜多染红细胞与成熟细胞之比是评价骨髓造血系统正常与否的敏感指标。比值过低表明骨髓中红细胞的生长发育受到一定抑制, 或具有细胞毒性^〔3〕。本研究结果显示, 随着照射剂量递增, 该比值迅速下降, 呈指数曲线规律, 至4 Gy时已接近于0, 表明此剂量下, 骨髓造血功能明显受到抑制。

骨髓细胞微核数增高作为全身一次性γ射线照射所引起的辐射损伤的表现之一, 又可以作为评价对辐射危害具有保护作用的指标^〔2〕。其中辐射损伤模型的建立至关重要。本研究结果显示, 小鼠经一定剂量γ射线全身照射后, 于不同时间收集胸骨骨髓检测发现, 在辐射损伤急性期微核率及PCE/NCE比值随采样时间推移, 均有明显下降趋势; 如照射后第1 d微核率高达41.8‰, 之后迅速下降, 至第3 d仅为3.3‰, 与常用辐射损伤模型微核率水平基本一致^〔5-6〕。本研究还发现, 骨髓细胞微核率并未随着照射剂量加大呈线性增加, 而是当照射剂量达到一定程度后微核率呈明显下降趋势。其原因可能与照射剂量加大后, 骨髓细胞发育过程受到明显抑制, PCE明显减少有关。因此, 在制备辐射损伤模型时, 除考虑照射剂量外还应考虑到取材时间等因素对结果的影响。