钙是人体必须的营养素, 既构成人体的结构组织, 又具有重要的生理调节功能。近些年研究发现, 膳食钙的摄入可以降低或改善血浆胆固醇浓度^〔1〕, 其机制是由于钙在肠道内抑制饱和脂肪酸的吸收^〔2〕和促进胆汁酸的排泄^〔3-4〕。本研究旨在探讨钙摄入量对高胆固醇血症模型大鼠肝脏胆固醇代谢关键酶3-羟基-3-甲基戊酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)和7α-羟化酶(CYP7A) mRNA表达量的影响, 为阐明其降低血浆胆固醇的分子机制提供科学依据。

(1)实验动物和饲料:健康清洁级雄性4周龄Wistar断乳大鼠40只〔沈阳药科大学实验动物中心, 许可证号: SCXK (辽宁) 2003008〕, 体重(100±10) g。高脂饲料由5%猪油, 1%胆固醇, 0.25%胆盐和93.75%的普通饲料组成。各处理组均为纯合成饲料, 按美国科学院国家研究实验动物营养需求标准配制^〔5〕。(2)主要仪器与试剂:磷酸氢钙(上海试四赫维化工有限公司); 总胆固醇(TC)测定试剂(北京利德曼生化技术有限公司); 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂(温州维日康生物科技有限公司)。RNA提取液、焦碳酸二乙酯(DEPC)(美国INVITROGNE公司); DNA Marker、逆转录和PCR扩增试剂盒(大连宝生物有限公司); 日立7170A型自动生化分析仪(日本日立公司); T3thermocycle PCR扩增仪(英国Biometra公司); GDS-8000凝胶成像仪(美国UVP公司); 28Rs低温冷冻离心机(德国Heraeus公司)。

动物适应7 d后, 随机抽取10只作为常脂常钙组, 喂饲普通饲料14 d; 其余模型组大鼠喂饲高脂饲料, 制备高胆固醇血症大鼠模型, 诱导期为14 d。诱导期结束后, 剔除血清TC浓度或体重异常动物6只, 再按TC和体重均衡的原则分为高脂常钙组、高脂中钙组和高脂高钙组, 每组8只, 分别饲以含有0.5%, 1.0%, 2.0%元素钙的纯合成高脂饲料共42 d。常脂常钙组除TC或体重异常动物2只, 饲以纯合成常脂常钙饲料42 d。各组动物单笼饲养, 饮用去离子水。定时计算摄食量并称量体重, 第21, 42 d结束时测定血脂指标。断头法处死动物, 取肝脏、心脏和双侧肾脏称重, 并分别计算其脏器指数。留取肝脏, 迅速放置-80 ℃超低温冰箱中保存以备检测HMG-CoA还原酶和CYP7A mRNA。取双侧股骨, 剔除附着组织。

实验0, 21, 42 d后, 采集空腹血, 取血清用全自动生化分析仪检测TC、HDL-C、LDL-C。排水法测定股骨密度^〔6〕。

(1)引物设计: HMG-CoA还原酶、CYP7A和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP DH)的引物核酸序列参照文献〔7-8〕, 由大连宝生物工程有限公司合成。(2)肝脏总mRNA制备及逆转录扩增; 按照试剂盒说明提取总RNA。紫外分光光度计上测定其在260, 280 nm的吸光度(A)值, 并计算RNA的浓度和纯度。取0.5 μg总RNA进行逆转录反应, 反应体系为10 μL, 包括: MgCl₂ 2 μL, 10×逆转录缓冲液1 μL, dNTP 1 μL, RNA酶抑制剂0.25 μL, 逆转录酶0.5 μL, 随机引物0.5 μL, 无RNA酶dH₂O补足至10 μL。该反应体系于30 ℃保温10 min, 退火温度42 ℃保持30 min, 99 ℃灭活5 min, 4 ℃保温。再加入80 μL PCR反应体系进行扩增步骤, 体系包括: 5 × PCR缓冲液20 μL, 灭菌蒸馏水51.5 μL, 扩增酶0.5 μL, 指标上、下游特异性引物各2 μL, 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上、下游引物各2 μL。PCR反应条件如下, 94 ℃预变性4 min后进入30个循环: 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 结束后4 ℃保温。PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后扫描, 紫外灯下观察目的条带。凝胶成像分析系统成像后测定目的条带的灰度值, 计算出目的基因与GAP-DH两者的灰度比, 即为HMG-CoA还原酶、CYP7A mRNA表达的相对量。

应用SPSS13.0统计软件进行方差分析和t检验。

实验期间, 高脂中钙组和高脂高钙组大鼠各有1只出现血尿现象, 并于次日死亡, 故在统计分析时将其剔除。尸检发现动物膀胱血尿充盈并有白色难溶性颗粒, 怀疑死于肾脏疾病。其余各组动物生长情况良好。高脂高钙组实验结束后有1只动物血脂异常增高, 统计分析时也将其剔除。实验期间, 各组大鼠摄食量和体重无明显变化, 常脂常钙组肝脏指数显著低于其他各组(P < 0.05), 高脂高钙组心脏指数和肾脏指数分别显著低于、高于其他各组(P < 0.05), 随着钙含量增加, 实验处理组大鼠骨密度也逐渐增加。

经14 d诱导, 高脂模型组大鼠TC浓度为(2.57±0.57) mmol/L (n=21), 是常脂常钙组(1.49±0.14) mmol/L (n=8)的1.72倍, 差异有统计学意义(P < 0.01), 表明高胆固醇血症大鼠模型建立成功。

实验42 d结束时, 常脂常钙组TC增高了0.09 mmol/L; 而高脂中钙组TC提升了0.08 mmol/L, 其幅度低于常脂常钙组, 说明适量钙摄入可抑制TC的提升; 高脂高钙组TC增加了0.24 mmol/L。实验初始(0 d), 高脂常钙组TC浓度为(2.47±0.50) mmol/L; 21 d后, TC显著下降至(2.05±0.72) mmol/L (P < 0.05); 42 d时, 高脂常钙组TC虽又升高, 但仍比实验初始下降了6.7%。另外, 各实验处理组于实验后期TC均出现上升。LDL-C变化现象与TC一致。仅高脂高钙组实验结束后HDL-C升高。

表 1

表 1 大鼠肝脏胆固醇代谢关键酶基因相对表达量(x±s)

表 1 大鼠肝脏胆固醇代谢关键酶基因相对表达量(x±s)

图 1

图 1 钙对CYt~AmRNA表达量的影响

图 2

图 2 钙对HMG-CoA还原酶mRNA表达量的影响

各高脂模型组中仅高脂高钙组HMG-CoA还原酶mRNA的表达量高于常脂常钙组; 高脂常钙和高脂中钙组HMG-CoA还原酶mRNA的表达量均低于常脂常钙和高脂高钙组, 但仅和高脂高钙组比较, 差异有统计学意义(P < 0.05)。另外, 各高脂模型组CYP7A的mRNA表达量均高于常脂常钙组, 但仅高脂高钙组和常脂常钙组之间差异有统计学意义(P < 0.05)

本实验与Vaskonen T^〔9〕研究结果一致, 但实验中高脂高钙组TC的异常增高, 可能与实验动物肝脏、肾脏损伤^〔10〕和血钙增高引起机体生理功能改变^〔11〕有关。因此, 处于病理状态的高脂高钙组不在讨论范围之内。另外, 实验后期各处理组TC浓度反弹, 可能原因是机体调节机制促使血钙分布于骨骼增加骨密度, 从而影响了钙对TC的干预。

钙降低胆固醇浓度的机制在于结合胆汁酸, 增加胆汁酸的排泄量, 进而消除机体近50%的胆固醇^〔12〕。而CYP7A是胆固醇转化为胆汁酸途径的关键酶, HMG-CoA还原酶是内源性胆固醇合成的限速酶^〔13〕。结果显示, 随着钙摄入量的增加大鼠肝脏HMG-CoA还原酶mRNA表达量呈现下降趋势, CYP7A的mRNA表达量呈现增强趋势。因此推断, 钙可使HMG-CoA还原酶和CYP7A的基因在mRNA水平上同时被调节, 这与徐超^〔14〕的推测相一致, 可能是其降低血浆胆固醇的机制之一。而钙摄入量对LDL-C、HDL-C受体mRNA的调节作用尚需进一步探讨。