2009, Vol. 25
2. 大连医科大学卫生学教研室
国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, ⅠARC)将苏丹红Ⅰ号(SudanⅠ)归类为第三类致癌物, 这类物质虽缺乏足够的使人类致癌证据, 但它的遗传毒性使其具有潜在的致癌危险。肝脏是苏丹红Ⅰ号的代谢器官, 同时也是酚类化合物的代谢场所。因此, 本研究选用人类来源的人肝癌症细胞(HepG2)细胞系作为体外试验物, 探讨羟基酪醇对SudanⅠ所致DNA氧化损伤抑制作用及可能的作用机制。
1 对象与方法 1.1 试剂苏丹红Ⅰ号, 外观呈红色粉末, 纯度 > 97%(德国Sigma-Aldrich公司)。苏丹红Ⅰ号以二甲基亚砜(DMSO)溶解, 贮存液浓度为10 μmol/L, -20 ℃保存。临用时用培养液稀释至所需浓度, 使DMSO终浓度为1%;羟基酪醇, 油状, 纯度为96%(日本Eisai Food & Chemical Co公司), 用三蒸水配成贮备液, -20 ℃避光保存。临用时用培养液稀释成所需浓度; 基础培养基(MEM)/非必须氨基酸(NEAA)、达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(DMEM)、1640培养基、胎牛血清(美国GIBCOBRL公司); 小牛血清(杭州四季公司); 低熔点琼脂糖(LMA)(美国PROMEGA公司); 正常熔点琼脂糖(NMA)(美国BIO-RAD公司); DMSO、核糖核酸酶(RNAse A)、21, 71-二氢二氯荧光素二乙酸脂(DCFH-DA)、郝希斯特33342(Ho-echst33342)、碘化丙啶(PT)(美国Sigma公司); 抗8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)单克隆抗体(日本NOF公司); UltraSen-sitiveTM S-P超敏试剂盒、3, 3一二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。
1.2 细胞系人肝癌细胞(HepG2)(中国协和医科大学)。细胞贴壁生长于MEM/NEAA培养液中, 培养液中加入10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)。培养环境37 ℃, 5%CO2。传代后取对数生长期细胞用于试验。
1.3 方法 1.3.1 单细胞凝胶电泳(SCGE)试验参照Singh修改的SCGE方法(又称彗星试验)〔1〕, 稍加改动。取对数期生长细胞用胰酶消化收获, 设置25, 50和100 μmol/L羟基酪醇3个预处理组, 100 μmol/LSudanⅠ单独对照组以及DMSO溶剂对照组。离心收集细胞, 预处理组加入不浓度的羟基酪醇; SudanⅠ单独对照组和DMSO对照组加入同体积的磷酸盐缓冲液(PBS), 37 ℃孵育30 min; 离心收集细胞, 800 r/min离心5 min; 弃上清, 预处理组和SudanⅠ单独对照加入苏丹红Ⅰ号100 μmol/L共同孵育, DMSO对照组加入1%DMSO; 37 ℃温育1 h, 离心去上清; 用PBS洗涤细胞2次, 重悬于1 mLPBS; 将细胞调至106cells/mL; 为避免凋亡或坏死细胞呈慧星样细胞而造成假阳性, 将细胞悬液50 μL与Hochst33342(8 μg/ mL)和碘化丙啶(PI)(50 μg/mL)混合, 避光染色15 min, 于荧光显微镜下观察。
1.3.2 细胞内活性氧(ROS)测定参考文献〔2〕方法。
1.3.3 细胞内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)免疫组化分析按照文献〔3〕免疫组化方法。
1.3.4 细胞内硫代巴比妥酸反应物(TBARS)的测定参考文献〔4〕方法。
1.4 统计分析采用SPSS11.5软件进行统计分析。2组间均数比较采用t检验。
2 结果 2.1 羟基酪醇对苏丹红Ⅰ号致DNA链断裂的影响(表 1)
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表 1 羟基酪醇对SudanⅠ诱导DNA链断裂的保护作用(x±s) |
SudanⅠ组、羟基酪醇预处理组及DMSO对照组均未见凋亡细胞, 细胞存活率 > 90%。SudanⅠ组HepG2细胞呈现慧星样, 尾长、及尾矩明显大于DMSO对照组(P < 0.01)。羟基酪醇预处理HepG2细胞30 min, 结果显示, SCGE试验各项指标明显下降(P < 0.01或P < 0.05), 提示DNA链断裂减轻并呈剂量依赖关系。
2.2 羟基酪醇对SudanⅠ至ROS生成增多的影响SudanⅠ作用于HepG2细胞1 h后, 细胞内ROS水平明显升高, 荧光强度达到(9.03±1.05), 与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。25, 50, 100 μmol/L羟基酪醇分别预处理30 min后, 细胞内的ROS水平明显降低, 荧光强度分别为(6.08±2.78), (5.28±0.64), (2.68±0.24), 差异有统计学意义(P < 0.01)。
2.3 羟基酪醇对SudanⅠ作用8-OHdGR的影响SudanⅠ组致HepG2细胞系8-羟基鸟苷(8-OHdG)表达明显增强, 与DMSO对照组间比较差异有统计学意义(P < 0.01)。25, 50, 100 μmol/L羟基酪醇分别预处理30 min后, 细胞内的8-OHdG的相对染色密度分别从(90.4±1.40)降至(65.0±1.60), (56.2±0.64), (20.5±0.09), 差异均有统计学意义(P < 0.01)。
2.4 羟基酪醇对SudanⅠ致脂质过氧化形成的影响Sudan Ⅰ致HepG2细胞的脂质过氧化水平明显升高, 脂质过氧化产物在535 nm处吸光度值达到(0.41±0.15), 与对照组(0.18±0.13)比较, 差异有统计学意义(P < 0.01)。25, 50, 100 μmol/L羟基酪醇分别预处理30 min后, 脂质过氧化水平均明显下降, 100 μmol/L羟基酪醇能完全抑制SudanⅠ所致的脂质过氧化产物生成。
3 讨论本研究结果表明, 羟基酪醇能够抑制SudanⅠ所到的HepG2细胞DNA链断裂和8-OHdG的表达, 并且呈剂量依赖关系。而且羟基酪醇能够明显降低由SudanⅠ产生的ROS过量生成, 同时100 μmol/L羟基酪醇剂量组能完全抑制苏丹红Ⅰ号引起的脂质过氧化产物的增多。过量生成的ROS能引起细胞氧化损伤, 如DNA氧化性损伤, 蛋白质氧化和膜脂质过氧化。据报道〔5〕, 细胞内8-OHdG表达增高与DNA单链断裂增多有关。体内研究发现, 8-OHdG表达增强与染色体断裂和姊妹染色单体交换增多也有关〔6〕。因此, 羟基酪醇能降低苏丹红Ⅰ号对HepG2细胞的氧化损伤可能是通过降低苏丹红Ⅰ号引起的ROS生成增加而实现。
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