中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (9): 1106-1107   PDF    
引用本文
张海英, 唐海桦, 梁钢, 唐安洲. 口腔鳞癌亲本细胞株与耐药细胞株蛋白谱差异[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(9): 1106-1107.
ZHANG Hai-ying, TANG Hai-hua, LIANG Gang, et al. Differential protein expression between oral squanmous carcinoma parental cells and multidrug resistance cells in vitro[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(9): 1106-1107.
口腔鳞癌亲本细胞株与耐药细胞株蛋白谱差异
张海英1,2, 唐海桦3, 梁钢2,3, 唐安洲2     
1. 广西医科大学公共卫生学院职业医学与环境卫生学教研室, 南宁 530021;
2. 广西医科大学药学博士后流动站;
3. 广西医科大学药学院
收稿日期: 2009-04-21
基金项目: 广西地方性高发疾病防治研究重点实验室开放基金(桂科能0630006-5E3K)
作者简介: 张海英(1973-), 女, 海南琼山人, 副教授, 博士后, 研究方向:职业卫生与分子毒理学。
通讯作者: 梁钢
摘要: 目的 探讨人口腔鳞癌体外培养亲本细胞株KB与耐药细胞株KBV200的蛋白质表达差异. 方法 在体外培养KB及KBV200细胞株, 采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI)及蛋白质芯片技术检测KB及KBV200蛋白质谱. 结果 体外培养的口腔鳞癌亲本细胞株与耐药细胞株的蛋白质存在差异表达, CM-10芯片共捕获102个蛋白, 发现差异峰19个, 其中15个差异蛋白在KBV200细胞中高表达, 4个差异蛋白在KBV200细胞中低表达. 结论 SELDI蛋白芯片技术检测口腔鳞癌亲本细胞株与耐药细胞株蛋白质的差异表达方法简便、敏感、重复性好.
关键词： 口腔鳞癌     亲本细胞株     耐药细胞株     蛋白质芯片     差异蛋白表达    
Differential protein expression between oral squanmous carcinoma parental cells and multidrug resistance cells in vitro
ZHANG Hai-ying, TANG Hai-hua, LIANG Gang, et al     
Postdoctoral Mobile Research Station of Pharmacy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
Abstract: Objective To investigate differential protein expressions between oral squamous carcinoma cell line KB and multidrug resistance cell line KBV200 in vitro. Methods The surface enhanced laser desorption ionization (SELDI) was used.The KB and KBV200 cells were harvested and then split by cell lysate solution.The protein mass spectra of the KB and KBV200 cells was detected by CM-10 chip based on SELDI protein chip technology. Results A total of 102 proteins were captured by CM-10 chip, and 19 differential peaks were found.Among those differentially expressed proteins, 15 were highly expressed, while 5 were lowly expressed in KBV200 cells. Conclusion SELDI technology is convenient, sensitive, and repeatable in the detection of the different proteins expressions between oral squamous carcinoma cell line KB and multi-drug resistance cell line KBV200.
Key words: oral squamous carcinoma     parental cell     multidrug resistance cell     protein chip     differential protein expression    

口腔鳞癌是头颈部肿瘤中最常见的肿瘤, 每年全世界有30万的新发病例〔1〕。化疗是治疗口腔鳞癌的主要手段之一, 但肿瘤细胞对化疗药物产生的耐多药常导致化疗失败。因此, 研究肿瘤耐多药机制及逆转药物开发成热点。表面增强激光解析电离子飞行质谱技术。SELDI (surface enhanced la-ser desorption/ionization)蛋白质芯片技术是近年来新兴的蛋白质组学技术, 具有简单、快捷、灵敏等特点, 是发现蛋白质标记物的理想方法〔2〕, 通过此技术, 可以筛选差异蛋白质, 这些差异蛋白质可以成为研究肿瘤多药耐药的分子标志物, 也可以进一步成为研究治疗和药物开发的靶点。本实验采用美国Ciphergen公司研制的SELDI蛋白质芯片技术, 分析了体外培养的口腔鳞癌亲本细胞株KB与耐药细胞株KBV200的蛋白质表达谱。

1 材料与方法 1.1 材料

口腔鳞癌细胞KB及其耐药株KBV200 (南京凯基生物技术有限公司); 高效液相色谱HPLC水、乙晴、三氟乙酸、芥子酸(Sinapinic acid, SPA)、肝素钠、CHAPS牛胆汁酸盐(美国Sigma公司); ProteinChip Biology System (PBSⅡ-c)质谱仪及蛋白质芯片CM-10 (弱阳离子交换芯片, 美国Ciphergen公司)。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

口腔鳞癌细胞KB及其耐药株KBV200, 用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基培养。KBV200细胞培养时加入200 ng/mL长春新碱(VCR)维持其多药耐药性, 实验前停1~2周, 取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 耐药细胞多药耐药性测定〔3〕

采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测VCR、阿霉素(AMD)、顺铂(DDP)、5FU、环磷酰胺(CYP)及阿糖胞苷(ara-C)等6种抗肿瘤药物, LOGIT软件计算IC50。耐药指数=(耐药细胞株IC50/亲本细胞株IC50)。

1.2.3 细胞总蛋白的提取

待细胞培养至铺满瓶底, 用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次, 按培养瓶底面积1 cm2加入10~15 μL细胞裂解液(U9缓冲液: 9 mol/L Urea尿素, 4 % CHAPS, Tris-HCl 40 mmol/L, 1% DTT, 每25 mL加入蛋白酶抑制剂1片)。快速混匀器混合5 s × 2次, 冰上静置30 min, 4 ℃ 12 000 r /min离心20 min, 取少量上清用于测定总蛋白浓度, 按试剂盒操作; 其余上清液分别装冻存于-80 ℃保存备用。

1.2.4 CM-10蛋白质芯片检测

生物芯片处理器经HPLC水洗涤后晾干; 芯片每孔加入CM-10 buffer 200 μL, 经400~600 r/min (固定转数)振荡5 min, 甩去孔中液体, 重复2次, 加入100 μL样品(终浓度1 mg/mL), 振荡1 h; 甩去样品, 加入CM-10 buffer 200 μL, 振荡5 min后, 洗涤2次; 加入HPLC水200 μL迅速甩干, 重复2次; 加入HEPES 200 μL快速冲洗1次, 立即甩干; 风干后, 加饱和芥子酸(SPA) 1.0 μL, 重复1次; 全干后测定。

1.2.5 数据采集和结果分析

采用Ciphergen Protein Soft-ware 3.2.0软件自动采集数据, 形成细胞蛋白质质谱图, BioMarker Wizard软件分析蛋白质质谱图和蛋白质峰强度, 筛选分子量差异有统计学意义的蛋白质。其中纵坐标(峰值)为蛋白质相对含量, 横坐标为蛋白质质荷比, 主要采集信号噪声比(signal-to-noise S/N) > 5为有效波峰, 质荷比(M/Z)为2 000~5 000的蛋白峰, 蛋白峰强度相差0.5倍以上者定义为差异蛋白质。

2 结果 2.1 KBV200多药耐性测定(表 1)
表 1 口腔鳞癌亲本和耐药细胞对抗癌药物细胞毒作用(x±s, n=3)

经诱导耐药口腔鳞癌细胞KBV200对VCR具明显抗药性, 耐药指数为56.7, 对ADM、DDP、5FU有交叉抗药性, 对CYP、ara-C交叉抗药性不明显。

2.2 口腔鳞癌细胞KB及其耐药株KBV200蛋白表达差异(图 1)
图 1 KB、KBV200样品蛋白质指纹图谱对照图

CM-10芯片共捕获102个蛋白质, 其中检测出19个差异蛋白峰, 可以鉴别KB、KBV200细胞(P < 0.05)。M/Z为6048, 4113, 10838, 4968, 1257, 2289, 3997, 5149, 5971, 22703, 7272, 10093, 4941, 9961, 10289在KBV200细胞中表达高于KB细胞, 7 879, 2 546, 3 824, 5654在KBV200细胞中表达低于KB细胞。

3 讨论

口腔鳞癌往往经过第一阶段的放、化疗后即可出现耐药(mutidrug resistance, MDR)。而MDR的产生机制非常复杂〔6〕。本次实验采用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片对口腔鳞癌亲本细胞株KB与耐药细胞株KBV200的小分子蛋白表达差异进行观察。SELDI-TOF-M S蛋白质芯片是Taylor医学院的Hutchens等〔7〕于1993年建立的一种检验方法, 用于检测肿瘤细胞株, 方法简便、重复性好、技术指标稳定, 是筛选小分子蛋白质较为可靠的蛋白质组学研究技术平台。

本次实验的重复性好、敏感性较高。体外培养的口腔鳞癌亲本细胞株KB与耐药细胞株KBV200的蛋白质存在差异表达。但是值得注意的是, 由于目前SELDI检测的仅仅是蛋白质质荷比(M/Z), 对蛋白质性质、作用、空间结构等的研究还需要进行大量后续工作, 如:筛选和鉴定已经报道的经典途径和非经典中涉及的相关蛋白质等, 以及建立相应的模型对逆转进行筛选等。因此, 本研究是采用高通量手段进行药物筛选的基础。

参考文献
[1] 聂玉梅, 钟睿. p53、p16基因在口腔鳞癌组织中表达的研究进展[J]. 实用癌症杂志, 2007, 22(4) : 428–430.
[2] Fung ET, Wright GL Jr, Dalmasso EA. Proteomic strategies for biomarker identification: progress and chanllenges[J]. Curr Opin Mol Ther, 2000, 2(6) : 643–650.
[3] 梁钢, 林晓贞, 唐安洲, 等. EGCG对人耐药口腔表皮样癌细胞株耐药逆转的实验研究[J]. 肿瘤防治研究, 2006, 33(4) : 56–57.
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[5] 张肃, 梁钢, 黄志明, 等. 儿茶素对耐药人口腔表皮样癌细胞KBV200凋亡的影响[J]. 中国药理学通报, 2004, 20(2) : 188–191.
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