研究者通过对世界上不同国家的谷物及动物饲料中的真菌毒素含量调查发现, 许多国家的谷物和动物饲料均不同程度地受到玉米赤霉烯酮毒素(zeralenone, ZEN)的污染并已导致对家畜的毒害。ZEN是一种真菌毒素, 雌性激素类物质, 是一种稳定的化合物, 其主要衍生物为α-玉米赤霉烯醇(α-zearaleno1)和β一玉米赤霉烯醇(β-Zearaleno1)。被污染的粮食如果被人或其他动物摄人, 就可能造成危害。根据中国《GB 13078.2-2006饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量》要求, 配合饲料、玉米中的ZEN含量应≤500 μg/kg。因此, 准确检测其含量则对保障食品安全有重要作用。为了解不同检测方法的应用情况及可行性, 本研究对ZEN检测方法包括化学检测方法、免疫学检测方法及其他检测方法, 特别是以免疫胶体金为基础的检测方法研究进展作一综述。

1 检测方法

ZEN及其衍生物可通过很多方法检测, 包括薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC), 气相色谱一质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS), 高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC), 高效液相色谱.质谱联用法(1iquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)和免疫学检测法。其中免疫学检测法较为方便、实用, 适合于大规模样品的快速检测。

1.1 化学检测方法

(1)薄层色谱法:TLC因其简单、成本低所以被广泛使用, 但灵敏度较其他方法低。美国官方分析化学师协会(Association of Analytical Communities, AOAC)规定的TLC法^〔1〕为:样品用三氯甲烷提取, 用色谱硅胶柱层析净化, 甲醇-三氯甲烷洗脱ZEN, 其检出限为300 ng/g, 灵敏度不高。(2)气相色谱一质谱联用法:GC-MS可同时检测不同的毒素, 包括己烯雌酚(Diethylstilbcstrol, DES)和ZEN等, 且具有较高的灵敏度。Rupp等^〔2〕利用GC-MS检测果汁中的ZEN, 最低检测限为30 ng/m L, 该方法现为AOAC官方检测方法。Blokland等^〔3〕用一种新的GC-MS检测了欧盟范围内牛尿及牛肉中的ZEN、α-zearalenol、β-zearalenol, 检测效果较好, 并发现与LC-MS/MS的实验结果有很好的相关性。但是设备的实用性问题使其不能作为常规检测方法。(3)高效液相色谱法:由于ZEN本身具有较强的荧光特性, 所以HPLC经常使用荧光检测。朱孟丽等^〔4〕利用HPLC测定饲料中玉米赤霉烯酮的方法, 样品经乙腈一水提取, 提取液通过净化柱、浓缩, 色谱柱分离, 荧光检测器检测, 外标法定量。对添加3个浓度玉米赤霉烯酮的玉米样品进行加标回收实验, 平均回收率为88.5%~93.1%, 变异系数为1.5%~3.9%, 最低检测限为10 μg/kg。叶蔚云等^〔5〕使用高效液相色谱法检测ZEN, 最低检测限为0.31 μg/kg, 最低检出量为0.03 ng, 此方法检测效果较为灵敏。(4)液谱和质谱联用法:LC-MS是一种非常灵敏的检测方法。Martina等^〔6〕饲喂牛含ZEN的饲料, 一段时间后采牛的尿液及组织, 并利用LC-MS对其中的ZEN进行分析。为了提高回收率和检测灵敏度, 一些研究者采用减少净化程序的方法^〔7〕。但LC-MS (LC-MS/MS, LC-MS/MS/MS)缺点是设备昂贵, 不适合广泛使用。化学检测方法虽然复杂, 但却是精确、可信的检测方法。

1.2 免疫学检测方法

(1)酶联免疫吸附测定法(enzye linked immunosorbent assay, ELISA):ELISA是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法, 适合于大批样品的快速筛选。世界范围内已有较多研究者使用ELISA检测ZEN^〔8〕。王玉平等^〔9〕研制了ELISA快速检测试剂盒, 采用间接竞争ELISA法, 最低检出浓度为1 ng/m L, 对玉米和小麦的平均加标回收率分别为96.5%和95.5%, 试剂盒4℃保质期超过6个月, 对相关真菌毒素的交叉反应率均 < 1%, 实验室内的变异系数 < 15%, 实验室问变异系数 < 20%。他们还将这种方法与HPLC相比较, 结果均在允许范围之内, 且2种检测方法基本无差别。因此, ELISA可用于大规模样品的检测, 而且具有准确、快捷、成本低、特异性好、灵敏度高等优点, 特别适合于基层大批量检测筛选样品, 在我国具有广泛的应用前景。阳性结果可再用HPLC等进一步确证。《中华人民共和国国家标准-饲料中玉米赤霉烯酮的测定(GB/T 19540-2004)》^〔10〕中规定:饲料中检测ZEN的仲裁方法为薄层色谱测定法, 酶联免疫吸附测定方法为快速筛选方法。(2)免疫胶体金快速诊断技术:胶体金免疫层析试验(Gold Immunochromatography Assay, GICA)是将免疫胶体金技术与层析技术有机结合起来建立的一种快速免疫学检测技术, 在医学上已有较多应用。目前免疫胶体金检测试剂已有10多种在临床上应用, 而动物医学方面的检测起步较晚, 近几年报道的较多, 已经开始引起兽医界的重视。目前医学检验中应用的免疫胶体金快速诊断技术主要有2种:斑点免疫金渗滤试验和免疫胶体金层析法。反应可根据待测物的不同, 选择不同试验方法, 反应模式主要有间接法、双抗体夹心法、捕获法、竞争法。

GICA以硝酸纤维素膜为载体, 利用微孔膜的毛细效应, 将已知的特异性抗原(或抗体)固定于膜上作为检测带, 胶体金标记物在玻璃纤维的结合释放垫上, 其一端与膜相连, 另一端与样品垫相连, 膜的另一端连有吸水垫。当加入液体样品(全血、血清、尿或其他体液)后, 样品通过样品垫扩散作用向前并通过含标记物的玻璃纤维, 与胶体金标记物反应, 然后一起向前泳动, 至检测线(固定有特异性抗原或抗体), 这样标记物与待测物的复合物会被检测线截获, 而出现明显而直观的红色结果。如果样品中不含待测物, 则会和游离标记物一起越过检测线, 到达质控线, 与质控线的抗体发生反应而显示红色条带。层析法测试条根据胶体金标记物的不同也可以分成竞争法和夹心法等不同反应模式。

Anna等^〔11〕对脱氧瓜萎镰菌醇和玉米赤霉烯酮进行了以免疫胶体金试纸为基础的多重检测。结果表明, 免疫胶体金试纸可以在短时间(10 min)内, 有效检测出样品中的脱氧瓜萎镰菌醇或玉米赤霉烯酮, 当2种毒素都含有时, 也可检测出来, 检测限分别为1 500, 100 μg/kg。这种方法具有可靠、快速、成本低、敏感性强的特点。以免疫胶体金试纸为基础的多重检测已经成为免疫学方法检测毒素的新趋势。一方面可以实现半定量/定量检测和检测多元化; 另一方面简单、快速, 可以节约成本。(3)其他检测方法:屠蔷等^〔12〕采用时间分辨荧光技术建立高灵敏的玉米赤霉烯酮间接竞争免疫分辨荧光免疫分析(ZEN-TRIFA)。用稀土离子Eu³⁺标记的羊抗鼠抗体进行示踪, 该方法的灵敏度为0.01 μg/L, 测量范围为0.01~20.00 μg/L, 批内和批间差异分别为7.2%和14.6%, 平均回收率为94.4%, 与玉米赤霉醇(ZER)的交叉反应率为15.16%。该分析方法稳定性好, 可测范围宽, 具有很好的应用前景。何庆华等^〔13〕利用噬菌体展示技术对一些真菌毒素进行模拟抗原的研究, 通过大量制备模拟抗原, 利用竞争性间接ELISA的方法对样品进行检测, 避免了直接加入毒素标品, 降低了实验成本, 保护了实验人员的身体健康, 从而为建立无毒检测食品、谷物和粮食中的真菌毒索体系提供了新的思路。

2 结语

Josephs等^〔14〕通过研究不同国家多个实验室ZEN的检测方法, 发现在检出浓度上变异系数较大, 主要是由于没有标准校对溶液。因此, 他们制作了浓度为(9.95±0.30)μg/mL的标准校对溶液, 希望各实验室能在毒素检出上统一标准。我国的ZEN检测工作也需要和西方国家同步, 以利于农业产品的出口, 避免陷入贸易壁垒。因此, 应采取适当的防范措施, 研制出具有简便、快捷、灵敏、成本低等特点的检测方法, 以适合大样品检测的使用。免疫胶体金试纸的检测方法适合以上要求, 以免疫胶体金试纸为基础的检测方法将成为检测玉米赤霉烯酮及其他真菌毒素的一大趋势。此外, 磁酶化学发光检测技术已经引起了研究者的注意。磁酶化学发光检测技术将磁性分离技术、化学发光检测技术与免疫学方法三者相结合, 综合了化学发光法灵敏度高、线性范围广、测定速度快, 以及免疫法的特异性、准确性好的优点, 能够将待测样本中极微量的毒素富集到免疫磁珠的表面, 提高检测的敏感性, 既节约了检测时间又可节省成本。因此, 该检测方法急需进一步开发和完善, 以更快进入检测领域。