亚洲带绦虫的流行-直是-个严重的公共卫生问题^〔1-4〕。对于该病的诊断, 传统的方法主要是询问病史以及病人自带排出的孕节前来就诊, 还可肛门拭子法检查虫卵及粪便淘洗法寻找孕节和头节, 以判定虫种和明确疗效。传统的方法虽可用, 但更需要寻找-个操作简便、特异性高的诊断抗原, 从而增加实验的敏感性和结果判定的正确性。长期以来, 很多学者致力于细粒棘球绦虫病(又称包虫病)的诊断抗原并初见成效。本课题组在在研究亚洲带绦虫功能基因组时发现-个基因与包虫诊断抗原P-29同源, 并对该基因进行克隆, 表达, 最终得到高纯度的蛋白, 并证明其具有免疫反应性, 因此认为该基因并不单-作为包虫病的诊断抗原, 可也作为亚洲带绦虫病诊断抗原的候选基因。

亚洲带绦虫病人、猪带绦虫病人及牛带绦虫病人血清取自粪检阳性的带绦虫病人。亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建、EST测序及Unigene分析与上海联合基因有限公司合作完成。原核表达质粒pET-28a (+)及大肠埃希菌BL-21/DE3(中山大学热带病防治教育部重点实验室)。

Ex Taq酶(大连宝生物工程公司); 异丙硫代-B-D半乳糖苷(IPTG美国Prom ega公司); NiIDA Agarose (cat No:69670)(美国Novagen公司); 蛋白分子量标准(立陶宛MBI公司); DNA凝胶回收试剂盒(中国铂尔生物科技公司); 质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司); 辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、兔抗人二抗、3, 3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司); 丙烯酰胺、尿素(美国MBCHEM公司); 氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。

亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库由本课题组构建^〔4〕。将获得的亚洲带绦虫unigene进行Blastx分析, 克隆号为Ta HC12-B4-T7P的序列是包虫诊断抗原P-29的同源基因。分析序列的特征、预测其理化性质。

根据已获得的包虫诊断抗原P-29基因全长编码序列的开放阅读框, 利用DNAClub和PCRdesign软件设计引物:上游引物:5'-CAAG-GATCCATGCTCAAC-3'带BamH1酶切位点, 下游引物:5'-AAAGTCGAGCTACTCGCCCAACATC0-3'带XhoⅠ切位点。以亚洲带绦虫成虫cDNA文库中编号为Ta HC12-B4-T7P的质粒为模板, TaKaRa Ex TaqTM酶进行聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因。反应总体积50 μL且PCR反应循环参数为:预变性, 94℃ 5 min; 变性, 94℃ 1 min; 退火, 57℃ 1 min; 延伸, 72℃ 1 min, 34个循环后72℃总延伸l0 min。PCR产物用0.8g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定回收。

PCR产物和pET -28a (+)载体分别用BamH1和XhoI双酶切, 回收、连接后转人大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞, 卡拉霉素筛选阳性克隆, 对阳性克隆依次进行质粒的提取, 双酶切和PCR鉴定。

取50 μL培养过夜的阳性克隆菌液, 加人含有卡那霉素的5 mL质脂双层(LB)培养基中(菌液/培养基为1/100), 37℃, 250 r/min振摇至A₆₀₀=0.4 -0.6时, 加人异丙基硫代-B.D半乳糖苷(IPTG)至终浓度1 mmol/L诱导表达5 h。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白质的表达。同时设pET-28a (+)质粒的诱导前后及重组质粒的诱导前作对照。

依据上述诱导表达方法对阳性克隆进行大量的诱导表达。离心收集菌体, 用基础液重悬菌体, 反复3次冻融, 放置冰上超声(功率150 W, 持续1 s, 停2 s, 共l5 min)裂解细菌, 收集上清和沉淀, 分别取上清和沉淀加入上样缓冲液, 煮沸5~10 min后行SDS-PAGE判断重组蛋白的可溶性。检测得到的包涵体(超声后的沉淀)用十二烷基肌氨酸钠(SKL)破包涵体并复性^〔6〕, 透析24 h后, 将样品加入预先处理好的Ni-IDA His.Bind树脂亲和层析纯化柱中, 最后再用磷酸盐缓冲液(PBS)透析以去掉过柱时留下的咪唑。

将上述方法纯化好的蛋白用10%的分离胶进行SDS-PAGE电泳, 使用电转印仪于冰上转膜(100 V, 1 h), 将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜, BSA室温封闭2 h; 再与亚带、牛带、猪带绦虫病人及正常人血清(按1:400稀释)结合, 4℃孵育过夜; 次日, PBS洗3次, 每次5 min, 然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG (按1:2000稀释)室温孵育1 h, PBS洗3次, 每次5 min; 3, 3二氨基联苯胺(DAB)显色至出现目的条带, 超纯水终止反应。

该序列推导的氨基酸序列与GenBank中细粒棘球绦虫包虫诊断抗原P-29同源性分值最高, -致性达到93%, 该基因全长1167 bp, 编码区为209~799 bp, 编码197个氨基酸。

图 1

注：M1：DNA标准(DL2000)；1：PCR产物；2：pET-28a (+)-包虫诊断抗原P-29重组质粒3：pET-28a (+)包虫诊断抗原P-29质粒双酶切；M2：DNA标准(DL15000)。 图 1 重组质粒的PCR和双酶切鉴定

将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定, 产物行0.8 g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示, 在600 bp左右有-清晰条带, 与目的基因大小基本相符, 此外重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列-致, 证明重组质粒构建成功。

图 2

注：M：蛋白Marker；1：pET-28a (+)质粒未加IPTG诱导；2：pET-28a (+)质粒加IPTG诱导；3：pET-28a (+)包虫诊断抗原重组质粒未加IPTG诱导；4：pET-28 a (+)包虫诊断抗原重组质粒加IPTG诱导；5：pET-28a (+)包虫诊断抗原上清；6：pE T-28 a (+)包虫诊断抗原沉淀；7：pET-28a (+)包虫诊断抗原纯化蛋白。 图 2 包虫诊断抗原P-29在大肠埃希菌中表达及其纯化产物

将构建好的重组质粒转化到E.coli/DE3中表达, 超声裂解后SDS-PAGE电泳分析结果显示, 在大约35 kD处出现高效表达条带, 与目的蛋白基本相符。通过破包涵体, 将蛋白进行纯化, 结果如图中第7泳道所示, 其位置与目的蛋白相符, 证明目的蛋白纯化成功。测得纯化产物的蛋白浓度为0.526 mg/mL。

用感染亚洲带绦虫、猪带绦虫的患者血清以及感染牛带绦虫的患者血清对纯化蛋白的WesternBlotting结果均显示出较清晰的条带, 而阴性对照血清在相应位置未识别出该蛋白条带。

本课题组在前期研究的基础上进行了亚洲带绦虫功能基因组学的研究, 包括亚洲带绦虫在分类地位、分子生物学诊断和疫苗等方面^〔7-8〕, 但是却忽略了诊断的重要性。

包虫诊断抗原P-29大量研究于细粒棘球绦虫病, 1999年, Gonzalez^〔9〕等用Eg原头节抗原单克隆抗体鉴定出-个抗原组分P-29且免疫组化研究显示, P-29定位于原头节外壳、顶突和包囊的生发层, 在包囊液和成虫提取物中没有。通过检验P-29与抗原5(又称抗原A)对不同单克隆抗体的交叉反应以及比较他们的多肽指纹图谱, 证明P-29与Ag5在免疫学上有相关性, 但二者是2种不同的蛋白质。在包虫病的诊断抗原中, 通过ELISA检测血清总G比较P-29和Ag5的诊断价值, 发现P-29的敏感性比AgS稍高, 但特异性有-定程度的下降, 因此, 被认为是包虫病重组抗原的候选基因们^〔10〕。

本研究将亚洲带绦虫成虫包虫诊断抗原P-29克隆到原核表达质粒pET-28a (+)中, 双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a (+)-Ta包虫诊断抗原P-29重组质粒构建成功。在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达, 表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定。结果表明, 该蛋白在全菌和沉淀中都有表达, 但在上清中未见表达, 说明包虫诊断抗原P-29是包涵体蛋白, 因此, 使用0.5%SKL溶解包涵体, 经变性处理并亲和层析纯化后, 得到了大量较纯的重组蛋白。Western Blotting结果表明, 该复合体具有较强的线性表位, 说明所获得的重组蛋白与猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫有较强的交叉反应。因此, 推测它不仅可作为细粒棘球绦虫的诊断抗原, 也可作为亚洲带绦虫的诊断抗原候选因子, 但是对亚洲带绦虫的诊断特异性不高, 由于该基因在亚洲带绦虫中的研究还是-片空白, 因此, 本次实验为进-步研究该基因的生物学功能、确定其作为绦虫诊断抗原的候选基因, 为探明其他生物学功能提供基础。