多药耐药基因(Multidrug -resistance gene, MDR1)、多药耐药相关蛋白(Multidrug -resistance associated protein, MRP1)是三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运子超家族成员, 它们在正常人体组织及很多肿瘤组织均表达。MDR1、MRP1过度表达是引起肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的重要原因^〔1〕。砷具有一定毒性, 但作为一种药物, 能够治疗诸如急性粒细胞白血病等多种疾病, 长期使用会导致机体产生抗砷性, 使其不能很好地发挥疗效, 故抗砷机制也越来越引起人们的重视^〔2〕。本实验用MDR1, MRP1的抑制剂维拉帕米(Verapamil), 受体拮抗剂MK571作用于稳定耐砷的抗砷细胞株, 检测其抗砷性变化, 明确其在抗砷过程中发挥的作用, 探讨可能的抗砷机制。结果报告如下。

(1)细胞株:使用4 μmol/L NaASO₂长期诱导28周培养的具有稳定抗砷性的抗砷细胞(本研究室保存)。(2)试剂与仪器:亚砷酸钠(NaASO₂), 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、1640培养基、0.25%胰酶、维拉帕米(Verapamil)、MK571 (美国SIGMA公司); 胎牛血清(美国Gibco公司); 其他试剂均为进口或国产分析纯。倒置荧光显微镜(日本Olympus公司); VarioskanFlash酶标仪(美国Thermo公司)。

细胞培养抗砷细胞在37 ℃, 5% CO₂条件下, 用含10%已灭活胎牛血清和双抗的1640培养基培养, 3 d传代, 用0125%胰酶1 mL, 37 ℃消化4 min, 终止消化后, 移入10 mL离心管中1 000 r/min离心10 min。弃上清, 沉淀中加入2 mL完全培养基制成细胞悬液后, 将细胞悬液平均铺入2个准备好的培养瓶中, 37 ℃继续培养。细胞单层贴壁, 密度均一。

取1瓶生长状况良好的抗砷细胞, 细胞计数后, 以10⁴ /mL的密度分别接种于96孔板中, 37 ℃ 5% CO₂条件下培养24 h, 待细胞贴壁良好后, 弃去培养液, 加入不同浓度的含亚砷酸盐浓度梯度培养液2, 4, 8, 16, 32, 64 μmol/L, 每种浓度12孔, 100 μL /孔; 分为Verapamil组, MK571组, Verapamil+NK571组及不加药物对照组, 每组设4个复孔。37 ℃继续培养48 h后, 加入5 mg/mL MTT 20 μL /孔, 作用4 h, 弃去旧培养液, 加入二甲基亚砜(DMSO) 100 μL /孔, 充分溶解后, 用酶标仪570/630 nm处检测吸光度(A)值。通过A值计算各浓度下细胞生存率及半数致死量(IC₅₀)。计算公式:生存率(%)=(加药孔A值-空白对照) / (对照孔A值-空白培养基对照) ×100%, 抑制率(%)=1 -生存率。IC₅₀通过药物抑制浓度计算软件(1.0.0版)累积比数(LOGTI)法得出。

取2瓶生长状态良好的抗砷细胞, 同前, 用胰酶消化, 离心后细胞计数。以10⁶/mL的密度铺入15个35 nm培养皿中, 每皿均加入8 μmol /L含亚砷酸盐的培养基1 mL, 而后分成5组, 每组3皿抗砷细胞, 每组均包括加入药物Verapamil, MK571和1个不加药物空白皿(对照组), 37 ℃、5% CO₂条件下培养, 分别在2, 4, 6, 8, 10 h收获细胞。每个时间点分别收获1组细胞, 计3皿。具体方法为:取出培养皿, 弃旧液, PBS冲洗2次, 加入优级纯硝酸, 使之掠过皿底后, 收集该液体。用原子荧光法检测不同时间段的各皿细胞内砷的含量。

应用SPSS 13.0软件进行统计分析, 采用析因设计的方差分析和t检验比较各时间点实验组和对照组生存率差别。

结合MTT实验, 在2~64 μmol/L砷浓度梯度下, 分别测试Verapamil, MK571的最适作用时间和浓度。结果显示, 二者均为48 h的结果较为稳定, 故时间选定48 h。设定Verapamil测试浓度分别为50, 100, 150, 200, 500, 700μmol/L, 各浓度下细胞生存率分别为0.77%, 0.64%, 0.81%, 0.75%, 0.83%, 0.80%, 以100 μmol/L为最适浓度; 设定MK571测试浓度为10, 30, 50, 70, 90, 100 μmol/L, 各浓度下细胞生存率分别为0.86%, 0.72%, 0.55%, 0.77%, 0.83%, 0.75%, 以50 μmol/L为最适浓度。

图 1

图 1 实验组与对照组在不同砷浓度梯度下生存率比较

MRP1抑制剂MK571在不同砷浓度梯度下, 能够明显逆转抗砷细胞的抗砷性, 使抗砷细胞生存率明显减低, 其IC₅₀为6.22 μmol/L; MDR1抑制剂Verapamil亦起到逆转作用, 在同样砷浓度下, 与对照组比较, Verapamil使抗砷细胞生存率降低, 但没有MK571明显, 且其IC₅₀为8.8 μmol/L, 小于对照组(IC₅₀=12.35 μmol/L); 同时给予上述2种抑制剂时, 其逆转作用更为明显, 其IC₅₀为5.23 μmol/L, 比单独给与MK571的逆转效果更好, 各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。

图 2

图 2 实验组与对照组不同时间点细胞内砷含量比较

原子荧光法(AFS)检测结果显示, 在2 h时, 3组抗砷细胞内的砷含量基本相同。随着时间增加, 实验组与对照组抗砷细胞内的砷含量不断增加, 实验组升高更为明显。在6 h时, MK571作用下抗砷细胞内砷含量开始超出其他组, 到10 h, 达到了最大值1.62 ng, 明显高出Verapamil组和对照组, 差异有统计学意义(P < 0.05)。

生物体在进化过程中, 长期暴露于含砷环境, 可产生不同程度的对砷耐受性, 具备了相应的对抗砷毒机制^〔3〕。原核和真核生物的抗砷机制研究较早, 目前明确了起作用的抗砷基因^〔4〕, 如大肠埃希菌的抗砷因子有R773质粒、金黄色葡萄球菌的pI258质粒等^〔5〕。2006年ChikArA KojimA等报道, 肺腺癌细胞(TRL15)耐砷细胞的MDR1、MPR1等基因表达明显上调^〔6〕。本课题前期用长期低剂量砷剂培养人膀胱癌细胞(ECV304细胞), 获得了具有砷抗性的细胞, 其能够对于急性大剂量的砷暴露产生耐受性; 而且通过基因芯片结果也证实, MDR1、MPR1基因表达增高^〔7〕。本次实验分别用DMR1、MPR1抑制剂Verapamil和MK571作用抗砷细胞后, 细胞生存率明显比对照组降低, 表明2种抑制剂能够逆转抗砷细胞对砷的耐受性; 抑制剂作用后的抗砷细胞内砷含量明显高于同步对照组, 提示其作用主要通过阻断抗砷细胞内砷的外排, 从而逆转其抗砷性。进一步通过MTT检测结果可见, MK571作用抗砷细胞在同等砷浓度下, 生存率明显低于Verapamil组, 且差异有统计学意义, 表明其逆转效果更好, 证明MPR1基因在抗砷过程中起到更重要作用, 这与Lee等报道相符^〔8〕。当上述2种抑制剂同时作用于抗砷细胞时, 细胞生存率下降, 但与MK571相比降低幅度不大, 可能是由于MDR1和MRP1基因在抗砷过程中的相互作用并非相乘关系, 而且它们没有完全逆转抗砷细胞的抗砷性, 说明还有其他的因素参与了抗砷作用。

对于生物抗砷的研究较多^〔9-11〕, 但目前为止, 尚未明确具体的抗砷作用机制。本实验初步证实了MDR1、MRP1基因在抗砷细胞产生耐受性的过程中发挥了重要作用, 但具体的抗砷机制, 还有待深入研究。