近年来，单味中药及中药复方防治肿瘤作用的研究较多^〔1〕。菱角(Water-caltrop)具有清热、解渴、健脾、益气明目之功效^〔2-4〕。前期实验表明，菱角水提物具有良好的抗肿瘤作用^〔5〕，但菱角多糖部分的抗肿瘤作用报道较少。本研究对菱角的粗多糖进行分离，初步探讨菱角粗多糖对Hela细胞、U251细胞的生长抑制作用，为深入研究菱角的抗肿瘤作用提供基础依据。

标准胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司); 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司); 二甲基亚砜(DMSO，美国Amresco公司); 胰蛋白酶(美国Gibco公司); 其他试剂均为国产分析纯。菱角采集于吉林省大安县，经吉林农业大学樊绍钵教授鉴定为东北菱(Water-caltrop)。

称取10 kg菱角皮于提取器内，以8倍体积的蒸馏水浸泡8 d，加热煮沸4 h，过滤后再以3倍体积的水重复提取2次，合并深色多糖提取液，过滤，浓缩。向提取液加入3/7倍体积的95%乙醇，离心弃沉淀，向上清液中加入1.0倍体积的乙醇，离心分离沉淀，冻干得多糖粗品F₁，依此方法，向上清液中先后加入1.5和4.0倍体积的95%乙醇，分别得到多糖粗品F₂和F₃。

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法^〔6〕。首先绘制标准曲线，经比色得曲线方程：y=0.018 9x，r=0.995 9。后将所得的吸光度值(y)代入回归方程，得到浓度值(x)，经计算可得出样品中多糖百分含量。

多糖的糖含量(%)=糖浓度×样品配制体积×稀释倍数/粗多糖的质量×100%。

按参考文献〔7〕MTT法检测粗多糖对Hela，U251细胞的生长抑制作用，浓度范围0~1 000 μg/mL。

使用碘化丙啶(PI)染色.收集各组细胞，预冷的70%乙醇于4 ℃固定12 h，流式细胞仪分析，激发光源为氩离子激光，激发波长为488 nm。

采用SPSS 13.0统计软件进行分析，2组之间的样本均数比较采用t检验，对数概率单位法求半数抑制浓度(IC₅₀)。

F₁糖含量19.07%，F₂糖含量25.20%，F₃糖含量39.25%。

倒置显微镜下观察对照组和各实验组细胞形态变化发现，随着菱角粗多糖浓度的增加，Hela和U251细胞的增殖受到明显抑制。表现为随着药物浓度的增加细胞数目逐渐减少，细胞的体积小、变形，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。Hela细胞24 h对照组细胞与加多糖组细胞形态发生变化; U251细胞24 h对照组与多糖组细胞形态发生变化。

图 1

图 1 菱角粗多糖对U251细胞的生长抑制曲线

图 2

图 2 菱角粗多糖对Hela细胞的生长抑制曲线

MTT法检测结果表明，菱角粗多糖作用24 h对Hela和U251细胞具有较强的抑制肿瘤增殖作用，最高抑制率均达70%以上，并且呈现良好的剂量-效应关系。其中，菱角粗多糖F₁对U251细胞24 h IC₅₀(μg/mL)为24.00，F₂为72.39，F₃为41.97;菱角粗多糖F₁对Hela细胞24 h IC₅₀(μg/mL)为49.65，F₂为65.30，F₃为48.18。

菱角粗多糖组分F₃中糖含量最高，并且随着F₃浓度的增加，对U251细胞的抑制率也增加，因此，采用流式细胞仪检测F₃诱导U251细胞凋亡的作用。流式细胞术分析结果显示，经多糖组分F₃作用U251细胞24 h后，流式细胞仪检测图谱上出现明显的亚二倍体峰，对照组U251细胞凋亡率仅为8.99%;U251细胞经F₃处理后，凋亡率为50.18%，表明F₃有诱导细胞凋亡的作用。

目前普遍认为，恶性肿瘤化学治疗药物引起肿瘤退缩的机制在于促进肿瘤细胞死亡和阻止其增殖，而细胞死亡既可以通过坏死又可通过凋亡的形式进行。与坏死不同，凋亡的细胞维持完整的细胞膜结构和功能，细胞解体后形成凋亡小体，不引起周围组织炎症反应^〔8〕。细胞凋亡成为恶性肿瘤化疗的新目标。

菱角多糖是由菱角中提取的天然活性成分，分子量小且为水溶性。本实验结果表明，菱角粗多糖能够抑制Hela、U251细胞的生长，并具有剂量依赖性。菱角粗多糖作用后细胞胞浆内颗粒增多、增粗，细胞膜边缘变粗糙。流式细胞术结果表明，菱角粗多糖F₃可诱导U251细胞凋亡。

综上所述，菱角粗多糖对Hela、U251细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用，这种作用具有周期特异性，但其具体作用机制有待于进一步研究。