目前，对沙门菌(Salmonella)的检测主要采用常规分离培养辅以免疫学检测技术，方法繁琐，耗时耗力，且易受环境因素和检验人员经验丰富与否的直接影响。随着分子生物学和细菌基因组学研究的发展，利用分子生物学技术进行微生物鉴定的方法逐渐被人们所关注^〔1〕，但目前所用方法由于缺乏分子诊断的黄金标准-基因序列，检验结果的假阴性率和假阳性率均较高。而常规的Sanger测序法^〔2〕仅在对大片段DNA进行序列测定时才显示出优势，且速度慢、成本高、通量低。有报道显示^〔3〕，在实际工作中，如果引物对选择的好，很短的一段特异序列的测定就可满足对病原体分子诊断的需要。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是一种快速、准确、实时进行短DNA序列分析的方法^〔4〕。本研究根据沙门菌fimy基因片段的保守性，成功建立了沙门菌的PCR-焦磷酸测序检测方法，并与GB/T4789.4-2003国标法^〔5〕进行比较。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)菌株：沙门菌159株; 宋内志贺菌2株; 单增李斯特菌54003、大肠埃希菌8099、金黄色葡萄菌ATCC 6538、阪崎肠杆菌ATCC 51329、铜绿假单胞菌ATCC 15442、肠出型大肠埃希菌O157:H7、假结核耶尔森菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌2a型、小肠结肠炎耶尔森菌、产酸克雷伯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、副溶血性弧菌、阴沟肠杆菌各1株。分离菌株分离自食品、粪便和呕叶物等样品中，均经VITEK-AMS32全自动微生物分析仪或API微生物鉴定系统鉴定(本中心菌毒种保藏室提供); 沙门菌标准株4株(H9812、ATCC14028、50115、50003;中国药品生物制品检定所)。(2)仪器与试剂：PCR扩增仪9700型(美国PE公司); 焦磷酸检测仪PyroMark ID型(瑞典Biotage公司); GoTaq Master Mix (美国Promega公司); 焦磷酸测序剂盒Pyro Gold Reagents、磁珠(瑞典Biotage公司)。

1.2 方法 1.2.1 引物设计

下载GeneBank上提供的沙门菌fimy基因序列16条，以基因序列比对软件DNAMAN进行序列比对，查找保守片段。以沙门菌fimy基因AE008721序列为模板，利用焦磷酸测序检测系统自带软件进行引物设计。上游引物(序列中位置89~112):5′-TGTTTAAGCCGGTAAACTACACGA-3′, 生物素标记5′端; 下游引物(序列中位置196~173):5′-CCGTACTGACTGGTTGATGATTGA-3′，产物长度为108 bp; 测序引物(序列中位置186~168):5′-TGGTTGATGATTGAAACTT-3′。

1.2.2 DNA模板制备

将各菌株复苏后，划线接种营养琼脂平板，37 ℃培养18~24 h, 用10 μL吸头挑取1~3个细菌克隆悬于50 μL的1×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺乙酸二钠(TE)溶液(pH 8.0)，在管壁适当研磨，震荡混匀，短暂离心，沸水浴5 min，冷却至室温，12 000 r/min离心5 min，取上清，分装保存于-20 ℃作为DNA模板。

1.2.3 PCR扩增

PCR反应体系：50 μL; 2×GoTaq Master Mix 25 μL, 生物素标记上游引物和未标记下游引物各10 pmol，DNA模板2 μL，加无菌去离子水至50 μL。扩增反应参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s, 53 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35个循环，72 ℃延伸5 min。取反应产物5 μL上样，2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.4 单链模板制备及焦磷酸测序

(1)将PCR产物30 μL转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入磁珠3 μL和结合缓冲液[Binding Buffer; 含10 mmol/L Tris-HCI, 2 mol/L NaCl, 1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA), 0.1% Tween 20, pH 7.6]47 μL, 常温震荡混匀10 min。(2)打开真空泵，将真空预装工具(Vacuum Prep Tool)在超纯水中清洗30 s，然后转移到96孔PCR板中，抓取磁珠，分别在70%乙醇、变性缓冲液(Denaturation Buffer; 0.2 mol/L NaOH)、洗涤缓冲液(Washing Buffer; 含10 mmol/L Tris-Acetate, pH 7.6)中清洗5~10 s, 再将其放入96孔测序板中，该板中预先加入测序引物0.3 μmol/L和退火缓冲液(Annealing Buffer; 含20 mmol/L Tris-Acetate, 2 mmol/L Mg-Acetate, pH 7.6)共45 μL，关闭真空泵，充分震荡摇动，释放磁珠。(3)将放有样品的96孔测序板在80 ℃放置2 min，自然冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。(4)设定程序，碱基投放顺序为TAGCGACAGTCGCTCTAGA, 根据程序给定剂量，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及4种碱基，将试剂舱和96孔测序板放入机箱进行测序反应。

1.2.5 样品检测

从集贸市场采集生鸡肉16份，按照GB/T4789.4-2003国家标准采用直接增菌法^〔5〕进行检测，可疑菌珠同时经API系统和VITEK-AMS32全自动微生物分析检测和鉴定。另取氯化镁孔雀绿增菌液1 mL加入1.5 mL离心管中，10 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀重悬于50 μL的1×TE溶液(pH 8.0)，沸水浴5 min，冷却至室温，12 000 r/min离心5 min，取上清作为DNA模板，进行PCR扩增和焦磷酸测序反应，方法同上。

2 结果 2.1 PCR扩增结果(图 1)

利用设计引物扩增各菌株的特异基因片断，沙门菌扩增出长度为108 bp的目的片段; 阴沟肠杆菌、宋内志贺菌、痢疾志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌均扩增出片段长度为600 bp的片段，其余各菌株均无扩增条带出现; 163株沙门菌扩增出相同长度的108 bp片段。

2.2 焦磷酸测序结果

按照特定碱基顺序加入程序进行焦磷酸测序，可很好测得每个菌株的目的片段序列; 结果同时显示，所测序列的第5位碱基和第11位碱基分别出现G、A和C、T的碱基置换：TAGCGCAAGGCGCCTCTTTAAAAGAAA→TAGCGCAAGGTGCCTCTTTAAAAGAAA→TAGCACAAGGCGCCTCTTTAAAAGAAA, 但不影响对沙门菌的鉴定结果; 其他菌株由于基因序列与碱基加入序列不一致，PCR扩增片段较长或PCR产物浓度较低而导致测序失败。

2.3 样品检测结果(图 2)

16份生鸡肉样品，采用国标方法检出4株沙门菌，采用PCR-焦磷酸测序方法检出6个样品中含有沙门菌。全部6株沙门菌的第5位碱基为G, 2份样品的沙门菌第11位碱基为T, 4份为C。为验证该方法是否具有假阳性，对16份样品重新进行检测，经过增菌液分离培养，仔细挑选可疑菌落，同时经API和VITEK-AMS32全自动微生物分析仪的检测和鉴定，16份样品最终检出6株沙门菌。

3 讨论

本研究采用PCR扩增和焦磷酸测序相结合的方法，进行大量沙门菌株的测序检测。结果显示，序列为5′-TAGCG/ACAAGGC/TGCCTCTTTAAAAGAAA-3′的27个碱基即可准确地鉴定沙门菌，从而建立了沙门菌的准确鉴定方法。该方法在普通PCR判断扩增产物长度的基础上，辅以目的片段的特异碱基序列进行菌株的鉴定，减少了由于PCR敏感性高而出现的假阳性结果，明显提高了检测特异性。同时采用该技术能够在4 h内完成一个样本从基因组DNA提取到测序结束的全部检测工作，时间上较采用国标法明显缩短，且检测阳性率明显提高，避免了由于人为因素所致的漏检。若以其作为辅助检测手段，进行沙门菌大范围筛查的快速检测，可明显提高检出率。

本文结果进一步提示，焦磷酸测序^〔6-8〕技术可以快速、准确、实时进行短DNA序列分析，检测通量高，可以同时进行多达96份样品的测序，且无需进行电泳，DNA片段也无需荧光标记，操作简单方便，可程序化，便于构建标准化操作流程和规范，从而很好地保证实验结果的稳定性和准确性。

本研究同时发现了fimy基因目的区域的碱基变化，该变化是否有规律可循，是否可用于沙门菌的进一步分型研究，以及该变异与沙门菌的致病性有无相关性，尚需进一步研究。