三氧化二砷(arsenic trioxide，As₂O₃)是中药砒霜的主要有效成分。新近研究发现，As₂O₃对多种肿瘤细胞具有广谱的细胞毒效应^〔1-2〕，被首选用于血液系统恶性肿瘤的治疗。本研究以人红白血病细胞株(K562细胞)为靶点，观察不同浓度的As₂O₃制剂对K562细胞增殖周期的影响及亚细胞结构改变，旨在为人红白血病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

0.1% As₂O₃溶液(哈尔滨医科大学第一附属医院)，以磷酸盐缓冲液配制成50 μmol/L储存液备用; K562细胞株(吉林大学基础医学院免疫教研室惠赠); 1 640培养基及四甲基偶氮噻唑蓝试剂(MTT，美国Sigma公司); 胎牛血清(长春生物制品研究所)。

1.2 方法 1.2.1 MTT比色法

取对数生长期的K562细胞，调细胞数为2×10⁵/mL，接种于96孔塑料培养板内，每孔100 μL。细胞生长达到80%汇合时分组，分别加入As₂O₃溶液1，3，5 μg/L，每个浓度10个复孔，同时设空白对照组，静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μL/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h后，吸弃上清，加入二甲基亚砜150 μL/孔，振荡10 min使MTT还原产物完全溶解，用酶标仪在570 nm处测定各孔吸光度(A)值，按公式：K562细胞抑制率=(1-加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100%计算K562细胞增殖抑制率。

1.2.2 流式细胞术

细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔塑料培养板改为25 mL培养瓶进行，培养结束后收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上机前过40目网，调细胞数为1×10⁶/mL，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测。细胞周期结果以Modifi2.0软件分析。

1.2.3 透射电镜

细胞培养及分组同1.2.2，收集不同组的K562细胞，移入锥形离心管内，离心弃上清，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电镜观察并拍照。

1.3 统计分析

采用SPSS11.0统计软件进行分析，细胞生长抑制率比较采用χ²检验，细胞凋亡率和细胞周期比值比较采用F检验。

2 结果 2.1 相差显微镜细胞形态学观察

不同浓度的As₂O₃与K562细胞共孵育24 h，对照组细胞生长旺盛，细胞发亮，折光性强，而其余各组细胞变圆，贴壁不佳，细胞数目减少，且随着As₂O₃浓度的增加，细胞改变越明显，呈剂量依赖关系。

2.2 不同组别细胞增殖抑制情况(表 1)

与对照组比较，其余各组K562细胞增殖抑制率随浓度增高而增高，差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.3 细胞周期各时相变化及凋亡率(表 2)

不同浓度的As₂O₃对K562细胞周期各时相变化及凋亡率均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，凋亡率上升，其余各组与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.01)。

2.4 电镜观察结果(图 1，2)

1 μg/L As₂O₃作用下K562细胞内的线粒体肿胀、胞质内有大量空泡形成，5 μg/L As₂O₃作用于K562细胞，细胞核染色质趋边凝集，细胞核破碎，可见凋亡小体。

3 讨论

人红白血病是血液系统的恶性肿瘤，其发生发展取决于细胞增殖与凋亡的相互作用状态。本研究采用多种方法观察As₂O₃对K562细胞的抑制作用，寻求其在红白血病治疗作用的理论可行性。本研究结果提示，As₂O₃阻滞K562细胞G₁期细胞向S期细胞转化进程，造成G₁期细胞增多，S期细胞减少，从而使G₂/M期细胞相对增多。G₂/M期细胞增多是细胞受损的普遍反应^〔3〕，也是细胞凋亡的一种表现。此外，Park WH等^〔4〕证实，As₂O₃ < 5 μmol/L能够使G₁期和G₂/M期细胞增加、S期细胞减少。王酉等^〔5〕应用As₂O₃诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的实验中亦获得了同样的结果。但砷在人体内存在蓄积倾向，具有毒副作用。因此，应进一步探讨As₂O₃最佳浓度或与多种化疗药物联合应用的最佳方案。