化妆品作为重要消费品其安全性日益引起重视。激素具有防止皮肤老化、除皱、增加皮肤弹性等作用，但长期使用含激素的化妆品易导致代谢紊乱和癌症^〔1〕，因此，我国《化妆品卫生标准(GB7916-87)》规定化妆品中不允许加入激素。化妆品中激素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)^〔2-3〕、薄层层析法、气相色谱-质谱联用法^〔4〕、液相色谱-质谱联用法等。目前应用最广泛的为HPLC法。超高效液相色谱技术(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)与传统的HPLC技术相比，大幅度改善了液相色谱的分析速度、分离度、只需较少样品量可得到较高灵敏度。本研究建立了同时测定化妆品中雌激素、雄激素、孕激素等7种激素的UPLC分析方法，该方法简便快速、灵敏度高，可应用于化妆品的快速检验。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

ACQUITY超高效液相色谱仪，配有二元溶剂管理器、样品管理器、柱温箱、紫外检测器、Empower TM数据处理系统(美国沃特世公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司); 高速离心机; 超声波清洗器; 乙腈、甲醇为色谱纯试剂(美国Fisher公司); 其他试剂均为分析纯。标准品:雌三醇、雌二醇、乙烯雌酚、睾丸酮(美国Sigma公司); 黄体酮(中国药品生物制品检定所); 甲基睾丸酮、雌酮(德国Dr ehrenstorfor GmbH公司)。

1.2 色谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY BEH C₁₈(1.7 μm, 2.1 mm×50 mm); 流动相:A:10%乙腈，B:乙腈/甲醇(3:1);梯度洗脱:0~0.5 min/90% A，10% B; 0.5~1 min:90%~78% A，10%~22% B; 1~4.5 min:78%~50% A，22%~50% B; 4.5~5.5 min:50%~15% A，50%~85% B; 5.5~6.5 min:15% A，85% B; 6.5~8 min:15%~90% A，85%~10% B; 流速:0.45 mL/min; 柱温:40 ℃; 样品室温度:25 ℃; 进样量:2 μL; 检测波长:230 nm; 采样速率:20点/s。样品测定采用色谱峰的保留时间定性，并以紫外吸收光谱图辅助定性，采用外标法以峰面积定量。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取一定量的激素标准品(精确至0.1 mg)，用50%乙腈-水(体积比为1:1混合液)溶解并定容至50 mL; 配制成雌三醇(E3)、雌二醇(E2)、乙烯雌酚(DES)、睾丸酮(T)、黄体酮(P)、甲基睾丸酮(MT)、雌酮(E1)标准储备液，质量浓度分别为1.076，0.988，1.118，1.056，1.244，0.923，1.253 mg/mL。取上述标准储备液适量用20%乙腈配制成混合标准溶液系列。

1.4 样品的制备

溶液状样品:准确称取样品1.0 g于10 mL具塞比色管中，在水浴上蒸除乙醇等挥发性有机溶剂，用50%乙腈水混合液稀释到10 mL，备用。膏状、乳状样品:准确称取样品0.2~1 g于100 mL锥形瓶中，加入饱和氯化钠溶液50 mL，硫酸2 mL，振荡溶解后转移至100 mL分液漏斗。以环己烷30 mL分3次萃取，必要时离心分离。合并环己烷并在水浴上馏除。用50%乙腈水混合液溶解残留物，转移到10 mL具塞比色管中，稀释到刻度。混匀后，经0.2 μm滤膜过滤，滤液备用。

2 结果 2.1 色谱条件的选择 2.1.1 检测波长的选择

通过全波长扫描可得到7种物质各自的吸收图谱。综合各物质在不同波长下的响应值及基线的影响，最终确定在230 nm波长下同时检测7种激素，可获得较高的灵敏度和较少的干扰。

2.1.2 流动相的选择

不同的流动相溶剂经常呈现出明显的分离选择性和洗脱强度的差异，分别对甲醇/水、乙腈/水、甲醇/乙腈/水等流动相体系进行了分析。结果表明，采用甲醇/乙腈/水作为流动相更有利于激素的色谱分离。睾丸酮、甲基睾丸酮、雌酮在甲醇/乙腈/水体系下可得到较好分离。

由于7种激素在极性上差异较大，等度洗脱条件下同时分离较为困难。而采用梯度洗脱的方法，经过对梯度洗脱条件的优化，在5 min内即完成了7种激素化合物的分离检测。结果表明，流动相的酸度对激素化合物的色谱分离影响不明显，见图 1。

2.1.3 柱温的选择

本研究先后在25，30，35，40，50 ℃等一系列柱温条件下进行试验，考察在不同柱温下7种激素的分离效果。结果表明，在40 ℃柱温下分离效果最佳。

2.1.4 线性关系、回收率与相对标准偏差(RSD)(表 1)

在确定的最佳分析条件下，配制一系列不同质量浓度的混合标准溶液进行测定，以各组分的峰面积对浓度绘制标准曲线。当信噪比(S/N)为3时，测得各激素检出限。称取经测定不含有激素的化妆品试样0.200 g，平行6份，分别加入标准混合溶液，充分混匀，进行测定。

2.2 UPLC方法和HPLC方法的比较 2.2.1 分析时间的比较

HPLC测定7种激素的分析时间大约为40~60 min。而本研究建立UPLC方法在5 min之内，在保证分离度的情况下分析时间大大缩短。

2.2.2 流动相溶剂消耗量的比较

同时测定化妆品中雌激素、雄激素、孕激素等各类激素，HPLC方法完成一次样品分析的流动相溶剂消耗量为40~60 mL (流速为1.0 mL/min)，而UPLC方法消耗量为3~4 mL，仅为UPLC溶剂消耗量的1/12~1/20。可见，采用UPLC方法可以在很大程度上节省溶剂消耗。

2.2.3 分离度的比较

超高效液相色谱采用了1.7 μm小颗粒填料技术，大大提升了色谱柱性能。此外，小颗粒填料技术还可以在更宽线速度范围内获得最佳的柱效。结果表明，7种激素在ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱上获得了最为理想的分离效果。7种激素组分色谱峰分离度依次为18.41，2.32，2.58，1.94，3.45，10.55，其中最难分离的雌酮与甲基睾丸酮的分离度也达到了1.94。

2.3 样品分析

应用本方法对护肤类精华液、眼霜、乳液等化妆品样品共8件进行了测定。结果均为未检出。

3 小结

采用超高效液相色谱技术在5 min内可分离检测化妆品中雌激素、雄激素、孕激素等各类激素含量，在3~300 μg/mL线性范围内，7种激素工作曲线的线性相关系数r > 0.998 8;最低检出限为0.3 ng; 平均回收率为100.1%~104.9%;相对标准偏差为0.9%~5.9%。此方法快速、灵敏，方便用于化妆品质量监督检测。