目前认为矽肺发病机制可能涉及矽尘诱导大鼠巨噬细胞(AMs)产生各种细胞调节因子^〔1〕，诱发氧化应激损伤^〔2-3〕，启动信号转导通路等而引起肺成纤维细胞增殖及细胞外基质的沉积, 进而形成以肺间质纤维化为主的矽肺。近年来对炎性细胞因子等与矽肺纤维化关系的研究比较多，而应激蛋白在影响矽肺发病过程中的作用在国内仅见对大鼠AMs经石英尘诱导的人胚肺成纤维细胞热休克蛋白(HSP 70)表达的研究^〔3〕。本实验在转录水平上观察染尘肺泡巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞HSP 70各亚型表达的影响。结果报告如下。

RPMI 1640培养基、MEM (Minimum Essential Medium)培养基粉剂、0.25%胰蛋白酶、新生牛血清、台盼蓝、Giemsa、RNA抽提及扩增试剂盒(上海晶美生物制品有限公司); 标准SiO₂粉尘(上外广电公司); 标准二氧化钛尘(TiO₂，中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所); 人胚肺成纤维细胞(HELF)(中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)。

标准二氧化钛尘(TiO₂)，其分散度为粒径 < 2 μm的为91.5%，2~5 μm的为8.5%，游离二氧化硅(SiO₂)为0%。SiO₂粉尘悬液制备：采用标准SiO₂粉尘，其中游离SiO₂ > 99.8%，Al₂O₃(三氧化二铝)占0.05%，Fe₂O₃(氧化铁)占0.01%，TiO₂、CaO (氧化钙)、MgO (氧化镁)痕量，经光衍射法检测粉尘粒径均 < 5 μm，均约为4 μm，占100%。以上粉尘(TiO₂、SiO₂)经180 ℃ 2 h高温消毒后用无菌RPMI 1640培养液配成2 g/L的粉尘悬液母液，冷藏备用。临用前将母液用无菌RPMI 1640培养液稀释为所需浓度。

30只健康SD大鼠，体重(200±10) g (合格证号：02-22-4)。采用支气管肺泡灌洗方法收集AMs，Giemsa染色，测定AMs纯度达95%，台盼蓝排除法计数存活细胞数达99%。用含10%新生小牛血清和青链霉素双抗的RPMI 1640培养液调成细胞密度为1×10⁹ AMs/L的细胞悬液，接种到6孔板中(每孔各2 mL)，37 ℃、5% CO₂孵育2 h。弃去上清，即得到较纯的AMs。将接种好的6孔板中分别加入一定量的粉尘溶液(TiO₂、SiO₂粉尘悬液)，用无血清的RPMI 1640培养液调节为0，6.25，12.5，25.0，50.0，100.0 mg/L (每个剂量组作3个复孔)并补足体积至2.5 mL/孔，37 ℃、5% CO₂孵育24 h后终止培养，上清液以0.22 μm滤膜的抽滤器抽滤后，用封口膜封口于-70 ℃储存备用。

用含10%新生小牛血清及青链霉素双抗的MEM培养液进行传代培养，5% CO₂，37 ℃恒温培养。MRC-5细胞常规传代培养至对数生长期，待细胞达到70%~80%融合后弃除上清液，胰酶消化、重悬细胞，调节细胞浓度为1×10⁹/L，2 mL/孔接种于6孔板。实验组加入经不同浓度染尘24 h AMs上清液; 对照组加入无染尘AMs上清各0.5 mL及无血清MEM培养基各2 mL; 空白组细胞仅加入2.5 mL MEM培养基(每组设3孔平行样)。培养24 h后移除上清液，贴壁细胞每孔加0.5 mL提取总RNA的试剂充分吹打混匀收集后保存于-80 ℃，提取RNA备用。

按说明书提取细胞总RNA。紫外分光法测定RNA纯度和含量。将RNA模板逆转录成cDNA。取1 μL上述反应液用PCR试剂盒对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、HSP 70-1、HSP 70-2、HSP 70-hom扩增，引物序列采用primer prmier5软件设计，由上海Sangon合成，GAPDH、HSP 70-1、HSP 70-2、HSP 70-hom引物序列(5′-3′)及长度分别为CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT，AGTCTTCTCCATGGTGGTGA AGAC，307 bp; CACCAAGCAGACGCAGAT，CCAGCCACGA GATGACC，482 bp; AGCTGGAGCAGGTGTGTAAC，GAAGGTGGCAGTGTTGATTC, 317 bp; TGAAGGGCAAGATTAGT GA，TGAAGGGCAAGATTAGTGA，515 bp; GAPDH、HSP70-hom扩增条件为：预变性5 min，循环数分别为26、28，每个循环包括：94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环结束后72 ℃终末延伸10 min。HSP 70-1、HSP 70-2扩增条件为：退火温度为56 ℃，其余同前，循环数均为28。反应结束后于2%琼脂糖凝胶中电泳，图像分析软件分析目的基因吸光度(A)值，以GAPDH为内参照，计算各基因相对表达丰度。

图 1

注：M、S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6分别为marker和空白组，对照组，6.25，12.5，25，50，100 mg/L SiO2粉尘处理的AMs上清液; M、T1、T2、T3、T4、T5分别为marker和6.25，12.5, 25, 50, 100 mg/L TiO2粉尘处理的AMs上清液。 图 1 MRC-5细胞目的基因和GAPDH的RT-PCR产物凝胶电泳图

图 1显示：SiO₂实验组的AMs上清液刺激MRC-5细胞24 h，其HSP 70-1、HSP 70-2、HSP 70-hom表达情况，其中空白组的HSP70-2未能检测到表达; TiO₂粉尘组与SiO₂实验组的比较尚需以GAPDH mRNA的表达作为内参分析各基因mRNA的表达丰度。

图 2

注：与空白组比较, a P < 0.05;与AMs对照组比较, b P < 0.05;与TiO2组比较, c P < 0.05。 图 2 诱导后的MRC-5细胞HSP 70-l、HSP 70-2、HSP 70-hom表达变化

图 2显示，经不同浓度SiO₂粉尘处理AMs的上清液刺激MRC-5细胞24 h后HSP 70-1、HSP 70-2、HSP 70-hom的表达丰度的变化趋势为在6.25 μg/mL组，HSP 70-2、HSP 70-hom的表达与空白组及AMs对照组比较，均呈现明显增高(P < 0.05);在粉尘浓度达到25 μg/mL时，HSP 70-2表达达到峰值，且随浓度上升呈现平缓上升; 粉尘浓度达到50 μg/mL时，HSP 70-1、HSP 70-hom表达也相应达到峰值，并随着染尘浓度增加的而缓慢升高; HSP 70-1、HSP 70-2、HSP 70-hom基因表达与粉尘浓度的相关系数(R)依次为0.931(P < 0.01)、0.923(P < 0.01)、0.818(P < 0.05)，呈现明显的剂量-反应关系。相同的染尘浓度下(25 μg/mL)，SiO₂剂量组的HSP 70-1的相对表达丰度与TiO₂组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。

热休克蛋白按分子量可分为HSP 60，HSP 70，HSP 90等，其中研究最为广泛的是HSP 70。HSP 70与细胞氧化应激密切相关^〔4〕，而尘肺形成与发展可能涉及氧化应激。本次研究结果提示：矽尘作用于AMs可能产生一定的氧化应激作用，其上清能使人胚肺成纤维细胞中的热休克蛋白被诱导表达，从而发挥一定的抗氧化作用。但是还需观察不同时间其表达水平的变化等情况才能确证应激蛋白的诱导动力学特征。通常情况下，基因组中仅有小部分基因进行表达，而且存在严格的时间和空间特异性。表达后的mRNA仍须经历贮存、转运、降解、翻译调控及产物(蛋白质)的翻译后加工(如糖基化、磷酸化、乙酰化和结构域拼接)，对mRNA以及基因与蛋白质线性对应关系的分析也难以反映基因的最终产物蛋白质的质与量的生物学特征。即基因组学的局限性源于基因组学仅涉及生物中心法则(DNA-RNA-蛋白质)的一部分，因此, 其确切作用有待于对其蛋白表达水平进行检测以及多方面验证后才能加以确认。