2009, Vol. 25
2. 云南省疾病预防控制中心;
3. 四川大学
苯并a芘(BaP)是多环芳烃类的典型代表, 在环境中普遍存在, 因其具有强致癌性而受到普遍关注。多项研究〔2〕表明, BaP经代谢活化后可引起多种形式的DNA损伤如DNA断裂或加合物的形成, 引起基因改变从而诱导多种基因异常表达, 如细胞色素P450。DNA加合物是DNA损伤中最常见的一种类型, 如果加合物不被修复, 则会引起碱基置换或缺失, 进一步引发肿瘤。依赖随机化末端连接物PCR (RDPCR)是在连接介导PCR (Ligation-mediated PCR, LMPCR)等技术的基础上进一步改进形成, 该技术不同于以往传统DNA损伤检测技术, 可以检测特定基因上能够阻止DNA聚合酶链延伸作用任何类型的DNA损伤。已有应用该技术成功检测出二氯联苯胺(dichlorlenxene DCB)对p53、ras基因DNA损伤作用的报道〔2-3〕。本研究结合RDPCR和克隆、测序技术, 在检测BaP对ras基因DNA损伤的基础上, 确定该损伤在核酸序列水平上的定位, 为提示BaP致突变/致癌的分子机制提供基础依据。
1 材料与方法 1.1 材料与制备(1)针对Genebank中人k-ras基因外显子2序列自行设计的引物。(2)细胞培养和DNA提取。人类淋巴母细胞(TK6细胞)用含10%马血清的1640培养基, 37℃、5%的CO2培养至对数生长期, 收获细胞, 常规酚/氯仿/异戊醇法抽提基因组DNA。(3)制备人类k-ras基因外显子2单链探针〔4〕。
1.2 实验对照设立由于HinfI在基因组DNAR的k-ras外显子2上只有一个酶切位点, 即位于外显子2第358与359号碱基之间, 故用HinfI酶世基因组DNA, 人为引入可抑制DNA聚合酶链延伸的DNA损伤, 以此为阳性对照模板; 阴性对照模板用超纯水代替。
1.3 BaP染毒TK6细胞培养至对数生长期, 加BaP入细胞悬液, 终浓度分别为1, 50, 200 μmol/L (最高染毒剂量下的细胞活性> 75%), 37℃、5%CO2条件下染毒90 min后收获细胞, 提取基因组DNA。BaP染毒基因组和阳性、阴性对照操作完全相同。
1.4 RD-PCR引物P1延伸:95℃变性5 min后, 95℃变性1 min、53.4℃退火2 min、75℃延伸80 s, 30次循环, 最后75℃延伸10 min。粘端连接; T4 DNA连接酶16℃温育过夜, 70℃ 15 min酶灭活。PCR:95℃变性5 min后, 95℃变性1 min、61.5℃退火2 min、75℃延伸80 s, 29次循环。
1.5 核酸杂交取5~10 μL的RD-PCR产物, 3.0%琼脂糖电泳, 变性, 转膜, 68℃预杂交2 h, 加地高辛标记单链探针, 68℃杂交12~16 h, 充分洗涤后, 按试剂盒显色4~16 h至条带清晰, 照相保存。
1.6 重复扩增取上述RDPCR产物以引物P3、PL作重复扩增, 产物与核酸杂交结果对比后回收纯化目的片段。
1.7 克隆测序上述纯化产物经加A、连接、转化、克隆; 克隆菌经PCR鉴定后送美国Invetrogen公司测序。
2 结果 2.1 PCR产物杂交显色结果(图 1)
|
M:k-ras基因外显子2的扩增产物; 1~3:染毒DNA BaP 图 1 BaP染毒基因组经RDPCR后杂交结果 |
图 1可见, BaP染毒终浓度为200 μmol/L时, 在超前外显子2的位置出现一杂交条带, BaP终浓度为1, 50 μmol/L未出现杂交条带, 表明BaP对k-ras基因外显子2有损伤作用。
2.2 测序结果(图 2)
|
注:A:BaP染毒DNARDPCR产物测序结果; B:Genebank中k-ras基因外显子2序列。 图 2 BaP引起k-ras基因外显子2DNA损伤的测序结果分析 |
BaP染毒基因组经RDPCR后, 产物重复扩增后, 测序结果(仅linker连接部分)与Genebank中k-ras基因外显子2相对应序列B进行对比。箭头右方序列为linker, 左方序列为k-ras基因外显子2上第67位碱基C。根据RDPCR原理, DNA损伤阻滞DNA的序列, 箭头所指碱基为k-ras基因外显子2聚合酶链延伸, linker与P1延伸末端相连。本研究中linker与k-ras基因外显子2上第67位碱基C相连, 可以断定其后一位碱基为阻滞DNA聚合酶延伸的损伤位点, 即第66位碱基T。故BaP染毒人类TK6细胞引起k-ras基因外显子2第66位碱基T发生损伤。
3 讨论有研究表明, BaP与肿瘤的发生关系密切。Culp SJ〔5〕等研究发现, 煤焦油和BaP喂饲小鼠, 可引起K、H-ras和p53基因形成加合物型DNA损伤, 并且均检测到k-ras基因突变。Gray DL也揭示BaP引起的肿瘤与H-ras基因突变和P21蛋白表达异常相关〔6〕。但这些研究均未能在核酸水平定位损伤位点。结合目前基因靶向治疗的趋势, 在DNA损伤未得到固定即在发生基因突变前定位损伤位点显得尤为重要, 不仅可针对易感人群进行筛查, 而且为基因靶向治疗提供宝贵信息。
本研究结果显示, 定位BaP引起的DNA损伤位于k-ras基因外显子2第59密码子上第3位碱基, 该密码子是突变发生的潜在靶点。尽管编码氨基酸密码子的第3位碱基并不会引起所编码的氨基酸发生改变, 但是研究表明, 同义密码子会影响蛋白质的二级结构〔7〕, 从而使蛋白质的功能发生改变。
ras基因是迄今发现的与肿瘤相关性最高的原癌基因, 其中以k-ras基因发生变异的频率最高, 肿瘤中约90%以上与k-ras基因突变有关。已有研究表明, ras基因的点突变单独可引起癌变〔8〕。本研究应用RDPCR研究DCB和BaP损伤位点, 均检测到k-ras外显子2的第59位密码子上发生DNA损伤, 提示该密码子是易受DNA加合物化学物攻击的位点。为今后同类型化学物的DNA损伤及其定位提供了基础依据。
| [1] | Chen JK, Wu ZL, Lin YG, et al. Effects of metabolibes of benzo (a) pyrene on umscheduled DNA synthesis in BALB/3T3 cell line[J]. Chemosphene, 2000, 41 : 139–142. DOI:10.1016/S0045-6535(99)00401-4 |
| [2] | 吴青, 衡正昌. 联苯胺对大鼠P53基因损伤作用及器官特异性研究[J]. 四川大学学报, 2006, 37(1) : 33–34. |
| [3] | 高绪芳, 文卫华, 饶朝龙, 等. 核酸序列水平定位DNA损伤的实验研究[J]. 四川大学学报, 2007, 38(5) : 202–204. |
| [4] | 高绪芳, 文卫华, 饶朝龙, 等. 短片段建立RDPCR将DNA损伤定位于核苷酸水平的实验研究[J]. 卫生研究, 2007, 36(2) : 159–162. |
| [5] | Culp SJ, Warbritton AR, Smith BA, et al. DNA adduct measurements, cell proliferation and tumor mutation induction in rdiation to tumor formation in B6C3F1 mice fed coal tar or benzo (a) pyrene[J]. Carcinogenesis, 2000, 21(7) : 1433–1440. DOI:10.1093/carcin/21.7.1433 |
| [6] | Gray DL, Warshawsky D, Xue W, et al. The effects of a binary mixture of benzo (a) pyrene and 7H-dibenzo (c, g) carbazole on lung tumors and k-ras oncogene mutations in strain A/J mice[J]. Exp Lung Res, 2001, 27(3) : 245–253. DOI:10.1080/01902140117535 |
| [7] | Komra AA, Lesnik T, Reiss C. Synonymous codon substitutions affected ribosome traffic and protein folding during in vitro translation[J]. FEBS Lett, 1999, 462 : 387–391. DOI:10.1016/S0014-5793(99)01566-5 |
| [8] | Tuveson DA, Shaw AT, Willis NA, et al. Endogenous oncogenic k-ras (G12D) stimulates proliferation and widespread neoplastic and developmental defects[J]. Cancer Cell, 2004, 5(4) : 375–387. DOI:10.1016/S1535-6108(04)00085-6 |