在引起人食品过敏的众多过敏原中，鱼是最重要的一种。世界粮农组织(FAO)1995年报告，90%以上的食物过敏是由牛奶、鸡蛋、鱼、贝壳海产品、花生、大豆、坚果类和小麦引起^〔1-2〕。鱼蛋白是高致敏的过敏原，在工业国家，例如法国和瑞典，对鱼过敏的人口占食品过敏人口的15.4%^〔3〕。在过去20年里，鱼类产品消费普遍上升，对鱼过敏现象也越来越常见^〔4〕。在中国摄入性过敏中对鱼和海鲜类过敏者最多，占过敏患者总数的36%^〔5〕。本研究选取我国南海地区常见热带海洋性鱼类点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)进行过敏原的分离、鉴定和纯化，为海产品过敏原的诊断和抗原的标准化研究提供理论依据。现将结果报道如下。

(1)主要仪器和试剂：快速液相色谱仪系统(FPLC System)(美国Pharacia公司); 常压层析控制系统、垂直板型电泳仪、转膜电泳仪(美国BIO RAD公司); 低温冷冻高速离心机(美国Simga公司)。生物素标记羊抗人IgE抗体(美国KPL公司); 链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)(美国Vector公司)。(2)生物材料：新鲜点带石斑鱼，2006年7月购于深圳市农贸市场，每条约0.6 kg，样品鲜活程度良好，无死亡; 过敏病人阳性血清来自深圳市人民医院、深圳市儿童医院，血清IgE检测为2级以上。

在冰浴中处理活的点带石斑鱼，收集鱼肉，称取约100 g的点带石斑鱼的鱼肉，充分研成碎末，分别加入5倍体积的预冷丙酮和乙醚于4 ℃交替去脂，其间冰浴中换丙酮5次、换乙醚3次，直到上清液澄清为止，用吸管尽量吸干丙酮和乙醚，并放于通风橱下至干燥。参照文献〔6〕，通过十二烷基硫酸钠-聚丙炳酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离点带石斑鱼蛋白质组分。

采用过敏患者血清，通过免疫印迹方法(Western-blotting)鉴定点带石斑鱼中特异性抗原成分。

参照文献〔7〕。

SDS-PAGE结果显示，点带石斑鱼粗提液含有蛋白条带有13条，含量高的有8条，分子量分别为43，34，28，22，17，15，9 kD，其中以34，28和9 kD处最为富集且蛋白分布相对均匀。

图 1

注：M：分子量标准; 1：过敏患者混合血清免疫印迹条带。 图 1 点带石斑鱼过敏原免疫印迹鉴定图谱

选用临床上对点带石斑鱼过敏患者的阳性混合血清为一抗进行免疫印迹试验。结果显示，可以看到有4条明显的阳性条带，分子量分别为22，25，28，34 kD。

图 2

注：M：分子量标准; 1~6：1~6峰的蛋白条带。 图 2 点带石斑鱼DE-52离子交换层析各峰液SDS-PAGE图谱

选用DE52离子交换层析柱对蛋白进行纯化，共得到6个洗脱峰，第1个峰远远高于后面5个峰。收集各峰后进行SDS-PAGE检测，结果显示，峰1中蛋白含量要远高于后5个峰，第4峰含22 kD的过敏原蛋白。

取第4峰进行免疫印迹试验，结果发现，第4峰有1条阳性条带，分子量为22 kD左右，通过免疫印迹证明，纯化后蛋白具有免疫活性，且能初步分离出22 kD的过敏原蛋白。

点带石斑鱼属于我国南海地区常见的热带海洋性鱼类，因此，可以一定程度上反映我国南海地区热带海洋性鱼类使人类产生过敏反应的普遍性。本研究结果显示，点带石斑鱼的主要过敏原分子量主要介于20~40 kD之间，与不存在地域性差异生存的鱼类如鳕鱼、鲑鱼和鲭鱼等主要过敏原分子量不同，这些鱼类主要过敏原均为12 kD左右的小清蛋白^〔8〕，有可能说明生存于不同海域的鱼类使人产生明显不同的过敏反应。本实验SDS-PAGE和Western blotting结果显示，点带石斑鱼蛋白粗提液的蛋白含量与其主要过敏原并不是呈对应关系。本研究初步纯化出点带石斑鱼的22 kD蛋白，为其过敏原的氨基酸序列测定和其抗原决定簇研究提供基础依据。点带石斑鱼的其他过敏原纯化监督有待深入研究。