甲状腺自体免疫甲状腺病(AITD)是一种有器官特异性的自身免疫病。碘是合成甲状腺激素的主要原料, 又是一类重要的甲状腺功能的调节因子。随着补碘防治碘缺乏病(IDD)的普及, 发现补碘使某些地区甲状腺自体免疫性疾病的发病率上升^〔1〕。流行病学资料表明, 水源高碘地区甲状腺自体免疫性疾病发病率明显高于低碘区, 尤其是甲状腺自体免疫性疾病格雷夫斯病(GD)发病率明显升高^〔2〕。有研究过量碘与甲状腺结构与功能的关系^〔3-6〕, 但是对过量碘致甲状腺自体免疫性疾病的机制目前并不明确。为此, 本研究在前期观察T₃、T₄, 促甲状腺激素(TSH), 促甲状腺激素受体抗体(TSHRAb)变化及甲状腺病理改变的基础上, 应用原位杂交、流式细胞分析等方法研究过量碘对促甲状腺激素受体表达和对树突状细胞抗原递呈功能等的影响, 从分子水平揭示过量碘导致甲状腺自体免疫性疾病的免疫调节机制。

刚断乳的清洁级BALB/c小鼠160只, 体重18~22 g。环境温度(20 ± 2) ℃, 湿度(60 ± 20)%, 照明时间(12 ± 3) h。定期清洁动物房以及动物用笼具、饮水瓶; 适应性喂养1周后, 按体重将动物随机分为6组, 分别给予自来水及含不同剂量KIO₃的高碘水。剂量分组: A组(正常对照组):自来水; B组(高碘1组): 1 500 μg/L I; C组(高碘2组): 3 000 μg/L I; D组(高碘3组): 6 000 μg/L I; E组(高碘4组) : 12 000 μg/L I; F组(高碘5组): 24 000μg/L I。

小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组白细胞介素4(rmIL-4) (美国PeproTech公司); 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD11c、CD80和藻红蛋白(PE)标记的MHC-Ⅱ、CD86分子(美国eBioscience公司); FITC标记羊抗兔的二抗(美国Southern-Biotech公司); Spectramax M2多模式测读分析仪/全能酶标仪(美国Molecular Devices/MD公司); 应用病理图像分析系统(北京航天航空大学); UFX-Ⅱ显微照相仪(日本Olympus公司); 流式细胞仪(美国BD公司)。

小鼠饲养3个月后, 取血和甲状腺, 测定其尿碘T₃、T₄、促甲状腺激素、促甲状腺激素受体抗体, 观察甲状腺病理切片, 测定促甲状腺激素受体mRNA表达。无菌取脾, 原代培养脾系树突状细胞(DC), 检测其抗原递呈功能。

采用竞争结合放免分析方法(RIA)测定血清T₃、T₄, TSH按试剂盒说明书操作; ELISA法测定TSHRAb; 原位杂交检测TSHR, 流式细胞仪测定DC表面标志物。

无菌取脾, 收集脾细胞悬液, 分离DC; 调整细胞因子浓度集落刺激因子(rmGM-CSF)为10 ng/mL)和rmI L-4为10 ng/mL, 体外诱导培养树突状细胞; 每2 d轻轻摇动培养板, 去掉漂浮以及附壁不好的细胞, 半量换液, 同时, 补充等量细胞因子; 培养7 d, 并在倒置显微镜下观察其形态和数量的变化, 强烈吹打收集DC。

光镜下观察细胞形态( × 200);倒置显微光镜观察细胞形态的变化。

流式细胞仪测定DC相对特异标志分子CD11c、DC细胞表面抗原组织相容性复合物Ⅱ类(MHC-Ⅱ)及协同刺激分子CD80、CD86蛋白表达, 用10 %胎牛血清(FCS) RPMI-1640培养液重悬DC, 1 000 r/min离心5 min。调节每管细胞数为1 × 10⁶ mL^-1, 细胞洗液洗涤2次。1%牛血清白蛋白(BSA)4 ℃孵育30 min, 封闭非特异性抗原。分别加异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体CD11c、CD80和藻红蛋白(PE)标记抗体MHC-Ⅱ、CD86, 以(PBS)代替抗体以及FITC标记非特异性IgG作为双阴性对照。4 ℃孵育40 min, 磷酸盐缓冲液PBS洗涤2次后直接流式细胞仪检测。

采用SPSS 10.0软件进行分析; 多组间比较采用方差分析, 进一步两两比较采用SNK分析, 剂量效应关系采用相关分析。

光镜下, 正常对照组的甲状腺滤泡中等大小, 呈圆形或椭圆形, 滤泡上皮细胞多为单层立方状或高柱状; 各高碘组小鼠甲状腺滤泡明显增大, 滤泡腔内充满红色胶质, 上皮细胞呈扁平状, 滤泡有融合现象。甲状腺功能变化主要表现为:血清TT₄、TSH升高、TT₃降低。TT₃、TT₄和TSH水平与碘均呈剂量效应关系, 尤其是TT₃和TSH, 相关系数分别为r=-0.65和r=0.677;对促甲状腺激素受体抗体的分析发现, 高碘摄入可升高小鼠血清TSHRAb的阳性率。

表 1

表 1 不同性别小鼠血清TSHR TSHRAb TSH的水平(x ± s)

表 1 不同性别小鼠血清TSHR TSHRAb TSH的水平(x ± s)

结果表明, 高碘摄入可升高小鼠血清TSH水平, 提高TSHRAb的阳性率, 可使小鼠促甲状腺激素受体mRNA表达水平升高, 从3 000 μg/L开始与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05), 说明TSHRAb与TSH竞争TSHR。

图 1

图 1 过量碘3个月原代培养树突状细胞DC (×200)

图 1所示, 培养至第7 d, DC形状典型-多角型或特征星型, 由胞膜呈树突状突起而成。这与其功能和高迁移性相符, 如长突起足以伸至周围组织之间, 利于捕获, 加工和递呈抗原。

图 2

注：与对照组比较，b P < 0.01。 图 2 饲喂过量碘3个月对小鼠树突状细胞DC表达功能的影响

结果表明, 过量碘摄入可使小鼠树突状细胞DC上共刺激分子CD80、CD86表达升高, 与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01), 并与碘摄入剂量效应关系。DC细胞表面MHC-Ⅱ类分子在高碘状态下表达明显升高, 与对照组比较差异有统计学意义, 并呈剂量-效应关系(r=0.963, P < 0.01)。高碘使DC细胞上特征表达标志CD11c表达增强, 剂量组与对照组比较差异有统计学意义, 并呈剂量效应关系(r=0.966, P < 0.01)。

本研究前期观察结果显示^〔3〕, 经过3个月的高剂量碘饮水喂养后, 检测与甲状腺自体免疫性疾病相关的指标, 发现过量碘致雌性小鼠外周血中可检出阳性率较高的类似人类GD的相关抗体TSHRAb, 且甲状腺组织器官出现相应损伤, 甲状腺功能也产生相应的障碍。高碘组动物甲状腺滤泡明显增大, 滤泡腔内充满红色胶质, 上皮细胞呈扁平状, 在高剂量组出现了滤泡腔的融合, 过量碘不仅使T₄、T₃水平发生异常, 而且使TSH的含量不恰当地增多, 提示高碘可导致甲状腺自体免疫性疾病的产生。本研究中, 过量碘作用3个月后, 血清TSH及TSH受体抗体阳性率均增加, TSH受体表达也增加。表明机体在过量碘作用下, 产生了TSH受体与TSH受体抗体之间的免疫识别反应, 其过度激活使本身免疫原性增强, 使甲状腺被淋巴系统作为靶器官进行攻击, 成为自毁性器官。推测TSHR与AITD的发生有关。基于分子免疫学机制, 本研究从高剂量碘水喂养的小鼠脾中分离DC并进行培养, 经DC形态学鉴定和表面特征标志CD11c表达检测, 证明为DC后, 分析其表面MHC-Ⅱ类分子、CD80(B7-1)、CD8(B7-2)的表达, 发现从6 000 μg/L剂量组开始, 它们的表达与正常对照比较差异均有统计学意义, 且高于正常对照组的表达, 说明过量碘作用下DC抗原递呈功能增强, 使自身抗体TSHRAb阳性率增加, 从而产生过量碘作用下的自身免疫反应。本研究中过量碘使DC共刺激分子CD80(B7.1)、CD86(B7.2) MHC-Ⅱ表达增强, CD86(B7.2)的表达明显高于CD80(B7.1), DC第一信号和第二信号活化并使抗原特异性初始型Th细胞向Th2细胞分化的表现, 使Thl/Th2比例失衡, 使针对自身的免疫反应增强, 自身抗体阳性率明显升高^〔8-9〕。