无色孔雀石绿(Leucomalachite green, LMG)是孔雀石绿(Malachite green, MG)在生物内的主要代谢产物和存在形式, 已被确证具有高毒性、高残留及"三致"等毒副作用, 主要污染水产品, 世界各国均立法禁止使用并进行强制检测^〔1-2〕。胶体金免疫层析法(GICA)是20世纪80年代初发展起来的一种新型快速免疫检测技术, 具有特异性强, 操作简便快捷, 成本低廉等优点, 已在医学检验、毒品监控、食品安全等领域得到广泛应用^〔3-5〕。本研究旨在将金标免疫层析法检测技术应用到水产品LMG的检测中, 为样品的现场快速测定提供新的方法。

1 材料与方法 1.1 试剂及设备

氯金酸(AR级, 上海化学试剂厂); 无色孔雀石绿(德国Sigma-Aldrich公司); 无色孔雀石绿抗体(江苏省苏微微生物研究有限公司制备); 牛血清白蛋白(BSA); 卵清蛋白(OVA), 羊抗兔二抗(德国Sigma-Aldrich公司); 硝酸纤维膜、玻璃纤维膜(美国Millipore公司); 紫外可见分光光度仪(GBCCINTRA10e, 澳大利亚GBC公司); 磁力搅拌器(RCTbasic, 德国IKA公司); 冷冻离心机(himac CR22F, 日本HITACHI公司); 点膜机(美国bio-dot公司); 微量移液器(Thermo, 美国热电公司); pH计(320型, 瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 GICA试纸条制备 1.2.1 胶体金制备^〔6〕

取0.1 g/L氯金酸溶流70 mL加热并搅拌, 沸腾后立即加入10 g/L柠檬酸水溶液2.1 mL, 搅拌至溶液呈稳定桔红色, 继续反应10 min, 停止。

1.2.2 胶体金抗探针的制备^〔7〕

取30 mL胶体金溶液, 用Na₂CO₃将pH调为9.0, 滴加0.72 mL 0.5 g/L的LMG抗体, 搅拌5 min。静置30 min后, 4℃, 7 500 r/min高速离心40 min, 弃上清, 沉淀用含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解, 离心, 弃上清, 沉淀用0.5 mL含5% BSA的PBS缓冲液溶解, 4℃保存备用。胶体金粒选择与鉴定参考文献〔8-11〕。

1.2.3 LMG金标试纸条的制备

自制金标试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫4个部分组成。先将LMG抗体配制成浓度12 mg/L, 放入玻璃纤维素膜, 浸泡后烘干, 4℃保存备用。在硝酸纤维素膜上用点膜机将LMG-卵清蛋白结合物(LMG-OVA)和羊抗兔IgG喷成2条线, 分别为检测线和质控线, 再用含1%BSA的PBS溶液封闭后真空干燥。将吸水纸, 硝酸纤维膜, 玻璃纤维膜, 加样纸, 依次粘于PVC背衬板上, 裁成细条备用, 试纸条检测原理同文献〔12〕。

1.3 样品检测 1.3.1 样品处理

取10 g剪碎的水产品于离心管中, 加入20 mL乙酸乙酸, 充分均质混匀。4 000 r/min离心10 min, 取上清于50℃水浴氮气吹干。在吹干样品中加入1:1环己烷-水溶液20 mL, 漩涡震荡提取3 min, 静置后取环己烷层, 再加入0.8 mol/L的HCl溶液0.2 mL, 漩涡震荡提取3 min后静置30 min。加入0.8 mL蒸馏水, 混匀后于8 000 r/min离心10 min, 弃去上层环己烷, 吸取下层清液, 再用0.8 mol/L的NaOH调整pH为6.0~8.0, 最后用0.01 mol/L PBS缓冲液定容至10 mL待测。

1.3.2 检测与结果判定

取样品提取液100 μL, 缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维素膜上, 将试纸条水平放置, 5 min后观察结果。如试纸条硝酸纤维素膜上仅1条红色带出现则判定为阳性; 如出现2条红色条带则为阴性; 若质控线不出现红色条带, 无论检测线是否出现, 测试结果均无效。

1.3.3 方法学指标的确定^〔13-14〕

(1)最低检出限实验:本试验条检出限:指从目测看得见检测线至完全看不见检测线时的浓度为最低检出限^〔15〕。将LMG标准品配置成160, 80, 40, 20, 10, 5, 0 μg/L等系列浓度, 观察各浓度显色情况, 判断最低检出限。(2)重复性实验:配制LMG为0, 20, 100 μg/L标准工作浓度, 每个浓度分别用8条试纸条检测, 观察各浓度显色情况, 根据显色来判断试纸条的重复性。(3)稳定性实验:将试纸条放入37℃环境下进行加速破坏性实验, 每隔24 h测定1次, (37℃下24 h相当于4℃于45 d的破坏效果), 检测LMG标准溶液0, 20, 100 μg/L观察试纸条显色情况, 折算后确定试纸条保质期。(4)交叉反应实验:将孔雀石绿、结晶紫、氯霉素、副品红、甲基蓝、四环素等标准物质配制12 500, 5 000, 1 000, 500, 100, 20, 0 μg/L系列浓度, 用试纸条进行检测。根据下列公式计算各类似物对LMG金标试纸条的交叉反应率(CR%)。CR%=(LMG的最低检出限/其他物质的最低检出限)×100%。

1.4 GICA与ELISA法比对实验

从市场上采集10份水产品, 经样品处理后分别用ELISA和GICA试纸条进行测定。设定100 μg/L为阳性对照浓度, 样品浓度高于100 μg/L判断为阳性, 低于100 μg/L则判为阴性。根据检测结果计算GICA与ELISA方法的符合率。符合率(%)=(判定结果相同的样本数/总的样本数)×100%。

2 结果 2.1 胶体金颗粒选择与鉴定

结果显示, 其颗粒大小对检测影响非常明显。本实验中确定的最低标记抗体蛋白量为10 mg/L, 最适标记抗体蛋白量2 mg/L。

2.2 检测指标

(1)最低出限(图 1):图 1可见, 本试纸条的最低检出限为20 μg/L。(2)重复性:实验结果表明, 在LMG浓度为0 μg/L时, 8条试纸均出现8条红色色带, 显示为阴性结果; 而在测定浓度为20和100 μg/L LMG标准时, 8条试纸只出现了1条红色色带, 显示为阳性, 表明试纸条重复性良好。(2)稳定性:该试纸条在37℃环境下能稳定检测结果9 d~, 推算出试纸条在4℃条件下可稳定保存12个月~。(4)交叉反应率:结果显示, 副品红、甲基蓝、四环素等物质未出现交叉反应现象, 而孔雀石绿、结晶紫、氯霉素与试纸条有交叉反应, 发生反应的最低浓度分别为100, 5000和12 500 μg/L, 交叉反应率分别为20%, 0.4%和0.16%。

2.3 GICA与ELISA对比实验符合率

分别用ELISA测试盒与GICA试纸条对10份水产品加标后的样品提取液进行测定。结果显示, GICA检测出9份阳性样品, 1份阴性样品, 而ELISA试剂盒检测出10份阳性结果。根据符合率计算公式, 可计算出GICA试纸条与ELISA试剂盒的符合率为90%, 表明本试纸条具有很高的准确性, 能够满足现场检测要求。

3 小结

本试纸条融合了单克隆抗体、纳米金以及膜层析等高新技术, 是金标免疫层技术的集成产品。胶体金颗粒的大小是试纸条质量高低的关键, 可通过柠檬酸三钠的量来进行控制。柠檬酸三钠加入越多, 获得胶体金颗粒直径越小, 反之则胶体金颗粒越大。胶体金颗粒太小, 结合蛋白量少, 反应结合率低, 另外难以显示明亮清晰的颜色, 影响显色效果; 胶体金颗粒过大, 其结合蛋白质稳定性差, 且难以通过膜孔径。本实验获得的胶体金粒直径为15~20 nm, 膜通过性好, 稳定易保存, 检测结果显色清晰易辨别。与薄层色谱(TLC)法、高效液相色谱(HPLC)法及ELISA法相比, GICA试纸条在进行LMG样品检测时不需要任何仪器, 也不需要添加其他试剂, 操作简便快捷, 结果灵敏准确, 检测成本低廉15 min内即可得到结果, 真正实现一步法(ONE-STEP)检测^〔11〕, 尤其适合于基层现场快速检测, 是检测水产品中无色孔雀石绿的有效方法。