中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (6): 733-735   PDF    
引用本文
李瑛, 王婧, 让欧艳, 邹丽君, 王穆, 郑宇, 唐小卿, 让蔚清. 甲醛致肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡作用[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(6): 733-735.
LI Ying, WANG Jing, RANG Ou-yan, et al. Effect and mechanism of formaldehyde on apoptosis of PC12 Cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(6): 733-735.
甲醛致肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡作用
李瑛, 王婧, 让欧艳, 邹丽君, 王穆, 郑宇, 唐小卿, 让蔚清     
南华大学公共卫生学院环境医学与放射卫生研究所, 湖南 衡阳 421001
收稿日期: 2008-12-12
基金项目: 国家自然科学基金(30572191);南华大学科研基金(DS02224);南华大学博士启动基金(5-2005-XQD-001)
作者简介: 李瑛(1975-), 女, 湖南衡阳人, 硕士在读, 主要从事食物药物毒理学研究。
通讯作者: 让蔚清
摘要: 目的 研究甲醛诱导肾上腺嗜铬细胞损伤特征及机制。 方法 将肾上腺嗜铬细胞瘤细胞与不同浓度甲醛(20, 40, 80, 160 μmol/L)共培养, 24h以后用四甲基偶氮噻唑蓝比色法检测细胞活力; Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡; 分光光度法检测乳酸脱氢酶漏出量; 硝酸还原酶法检测细胞上清液一氧化氮含量; 生化法检测总一氧化氮合酶活性和诱导型一氧化氮合酶活性; 磷酯酰丝氨酸结合蛋白-异硫氢酸荧光素/碘化丙啶双染法、流式细胞仪分析细胞死亡; 免疫着色实验技术检测半胱氨酸蛋白酶-3前体表达。 结果 20~160 μmol/L甲醛诱导细胞死亡, 低剂量甲醛( < 80 μmol/L)主要诱导凋亡, 高剂量甲醛( > 80μmol/L)主要诱导细胞坏死; 细胞乳酸脱氢酶漏出量具有甲醛浓度依赖性, 从(374.04±15.64) U/L增加至(800.18±24.84) U/L, 且一氧化氮含量逐渐升高, 与对照组比较, 差异有统计学意义(P < 0.01)。甲醛浓度依赖性诱导总一氧化氮合酶及型一氧化氮合酶活性表达增加, 半胱氨酸蛋白酶-3前体蛋白酶原表达随甲醛浓度逐渐增强; 氨基胍保护组细胞损伤明显减轻。 结论 甲醛呈浓度依赖性诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞死亡; 机制与半胱氨酸蛋白酶激活有关; 氨基胍对细胞损伤有保护作用。
关键词： 内源性甲醛     肾上腺嗜铬细胞瘤细胞     一氧化氮合酶     一氧化氮     半胱氨酸蛋白酶-3     氨基胍    
Effect and mechanism of formaldehyde on apoptosis of PC12 Cells
LI Ying, WANG Jing, RANG Ou-yan, et al     
Environmental and Irridiation Hygiene School of Public Health, Nanhua University, Hengyang 421001, China
Abstract: Objective To study the effect and mechanism of apoptosis of pheochrom ocytom a cells (PC12) induced by foRn aldehyde. Methods The viability of PC12 cells was detected by MTT.The apoptosis was measured by Hoechst 33258 fluorescence staining.The transudation content of LDH was deteun fined by colounetry reaction.The nitrite content of the cullure medium was measured by nitrate reductase method.The apoptosis of NOS and 1NOS were measured by biochemical method.The apoptosis of cells was detern fined by double-staining (Annexin-F1TC/PI) and flow cytometry.The procaspase-3 expression level in PC12 cells treated by form aldehyde was detected by westen blot. Results The content of 20-160 μmol/L foun aldehyde induced apoptosis in PC12 cell The low dose of foun aldehyde ( < 80 μmol/L) mainly induced apoptosis, while the high dose of foun aldehyde (>80 μmol/L) mainly caused necrosis The content of LDH in supernatant and the amount of NO were gradually increased with the increment of the form aldehyde concentration.Form aldehyde promoted the activities of NOS and iNOS in a dose-dependent manner.With the increment of the form aldehyde concentration, the expression level of procaspase-3 was increased gradually.The damage of PC12 cell was abated significantly in AC-treated group. Conclusion Founaldehyde could induce the apoptosis of PC12 cells in a dose-dependent manner via caspase pathway.AC could protect PC12 cells against the damage induced by form aldehyde.
Key words: endogenous foun aldehyde     PC12 cell NOS     NO     caspase-3     AC    

神经细胞凋亡是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森病等神经退行性疾病的重要病理作用机制之一〔1〕。胺基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)广泛分布于内皮、平滑肌、脂肪细胞，与血管性痴呆和阿尔茨海默病等密切相关〔2, 3〕, 能催化体内胺类物质分解释放大量醛类物质如内源性甲醛(Formaldehyde, FA)〔2〕。后者直接诱导细胞凋亡〔4〕, 诱导形成tau淀粉样聚集物，诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y神经瘤细胞)凋亡〔5〕; 启动内皮功能损伤导致心血管疾病〔3〕。本研究以肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)为实验对象，观察甲醛诱导PC12凋亡，探讨其作用机制。

1 对象与方法 1.1 材料

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化的细胞株，具有典型的神经细胞特征(美国菌种保藏中心，ATCC细胞库); RPMI-1640培养基(美国Gibco公司); 小牛血清(杭州四季青公司); bisBenzimide H 33258 (Hoechst 33258, 凋亡检测试剂盒)染色试剂盒、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、磷酯酰丝氨酸结合蛋白-异硫氢酸荧光素(Annexin V-FITC)试剂盒、蛋白含量(Western Blot荧光法)检测试剂盒，十二烷基磺酸钠(SDS)、土温-20(Tween-20)、甘氨酸(美国Sigma公司); 兔抗鼠半氨酸蛋白酶-3(Caspse-3)多抗(美国Neomarkers公司); 兔抗鼠β-肌动蛋白(β-actin) IgG、辣根过氧化酶标记(HRP)羊抗兔IgG (美国Santa Cruze公司); 丙烯酰胺和N, N' -亚甲基双丙稀酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、蛋白质浓度(BCA)试剂盒(美国Calbiochem公司); 胰蛋白酶(美国Amerseco公司); 诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂氨基胍(Aminoguandine hydrochloride, AG, 美国Alexis公司); 一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、一氧化氮合酶分型(NOS, iNOS)测定试剂盒(南京建成生物工程公司); 甲醛、过氧化氢(H2O2)及磷酸缓冲液(PBS)试剂均为国产分析纯。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养及实验分组

含15%小牛血清RPMI-1640培养基稀释细胞至1×105, 1.2×105, 2×105个/mL，分别接种至96, 24, 6孔培养板中，以甲醛、H2O2、iNOS抑制剂AG分别处理细胞，24 h后收集细胞观察各指标。正常对照组：与处理组等体积的PBS; 甲醛处理组：终浓度分别为20, 40, 80, 160 μmol/L甲醛; 药物保护组(甲醛+iNOS抑制剂)100 μmol/L iNOS抑制剂AG作用24 h后，80 μmol/L甲醛; 阳性对照组：终浓度为100 μmol/L过氧化氢。

1.2.2 细胞形态学检测

去培养基，4%多聚甲醛固定10 min; 磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，摇床洗涤每次3 min，去液体; Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡按说明书操作。荧光显微镜(Olympus BX51)观察细胞内荧光并拍照。

1.2.3 细胞死亡测定

Annexin V-FITC结合流式细胞仪检测细胞凋亡与坏死。按照Annexin V-FITC试剂盒说明书操作，应用流式细胞仪进行分析。

1.2.4 MTT法检测细胞存活率

PC12细胞培育于96孔培养板，MTT法检测细胞活力，酶标仪上读取570 nm处吸光度(A)值。生长抑制率(inhibitory rate, IR)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.2.5 细胞培养液中LDH活性测定

分光光度法检测LDH漏出量，在WFJ 2100型分光光度计波长440 nm处读取吸光度。根据试剂盒说明书计算LDH活力。

1.2.6 细胞上清液中NO含量测定

硝酸还原酶法检测细胞上清液中NO的含量。根据试剂盒说明书测定NO浓度。

1.2.7 细胞内NOS活性的测定

根据试剂盒说明书测定并计算总NOS活力和iNOS活力。

1.2.8 免疫印迹分析(Western blot)

2×SDS加样缓冲液裂解PC12细胞，应用BCA试剂盒进行样本蛋白定量。按照Western blot荧光检测试剂盒检测Caspase-3蛋白表达，Actin条带作为内对照，测定显带密度。

1.3 统计分析

采用SPSS13.0软件进行统计分析; 组间差异采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，采用Sigma Plot10.0软件制作统计图。

2 结果 2.1 不同浓度甲醛对细胞形态的影响

荧光显微镜观察，正常细胞核大，均匀低强度荧光; 典型凋亡细胞体积缩小、核呈致密浓染的固缩形式或碎块状致密荧光，颜色发白，随甲醛浓度增高加重，160 μmol/L甲醛未进一步加重细胞凋亡。过氧化氢组细胞体缩小、核固缩、呈碎块状致密荧光凋亡形态。AG明显减少细胞凋亡。

2.2 甲醛对PC12细胞凋亡的影响(图 1)
注:与对照组比较, aP<0.05, bP<0.01;与80 μmol/L甲醛组比较, cP<0.01, (x±s, n=3)。 图 1 Annexin-V-FITC加PI双染检测PC12细胞早期凋亡与坏死

Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染色流式细胞术分析：活细胞FITC及PI均低染(FITC-PI-)，流式细胞分析图的左下区细胞簇; 凋亡细胞FITC高染、PI低染(FITC+PI-), 为右下区细胞簇; 坏死细胞FITC和PI均高染(FITC+PI+)，为右上区细胞簇。PC12细胞凋亡率随甲醛浓度逐渐增加。从(2.47±0.23)%升高至(23.39±1.02)%，与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.01);细胞坏死率也同时增高，以160 μmol/L甲醛最明显。AG明显减少细胞死亡，与80 μmol/L甲醛浓度组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.3 甲醛对PC12细胞生长活性的影响(表 1)
表 1 不同浓度甲醛对PC12细胞生长抑制率的影响(……x±s, n=18)

甲醛明显抑制PC12细胞生长活性，过氧化氢组A值明显减小，与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)，细胞生长抑制率增加。AG明显减轻甲醛对细胞生长的抑制作用。

2.4 甲醛对PC12细胞上清液LDH活力的影响

甲醛诱导细胞上清液LDH活力呈现2个特点：较低剂量( < 40 μmol/L)甲醛使细胞上清液LDH活性稍有降低; 中、高剂量(>40 μmol/L)甲醛明显诱导LDH漏出，从(374.04±15.64) U/L升高至(800.18±24.84) U/L, 与对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)。过氧化氢组LDH活力(919.36±43.88) U/L, 明显高于对照组(P < 0.01)。AG减轻甲醛诱导的LDH漏出。

2.5 甲醛对PC12细胞上清液中NO的影响

随着甲醛浓度增加细胞培养液NO含量从(488.34±33.05)μmol/L逐渐增高至(755.66±17.38)μmol/L, 明显高于正常对照组(P < 0.01)。AG明显减轻甲醛诱导的NO升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.6 甲醛对PC12细胞NOS活性的影响(图 2)
注:与对照组比较, aP < 0.05, bP < 0.01;与80 μmol/L甲醛组比较, cP < 0.01(x€±s, n=6) 图 2 不同浓度甲醛对PC12细胞NOS活性的影响

甲醛浓度依赖性的增加PC12细胞NOS及其亚型iNOS活性，与对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)。AG降低甲醛诱导NOS活性，包括iNOS活性的降低，差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.7 甲醛对PC12细胞caspase-3蛋白表达的影响(图 3)
注:1:对照组; 2:20 μmol/L甲醛; 3:40 μmol/L甲醛; 4:80 μmol/L甲醛; 5:160 μmol/L甲醛; 6:100 μmol/L H2O2; 7:对照; 8:80 μmol/L甲醛+100 μmol/L AG; 9:80 μmol/L甲醛; 10:100 μmol/L H2O2。 图 3 不同浓度甲醛对PC12细胞caspase-3蛋白表达影响

Western blot结果显示，不同浓度甲醛处理PC12细胞24 h后，随着甲醛浓度的增加，caspase蛋白酶的前体形式procaspase-3蛋白的印迹明显增强，为细胞发生凋亡、caspase蛋白酶发生剪切激活的表现。iNOS抑制剂AG减少procaspase-3蛋白表达。经凝胶成像分析系统分析灰度扫描后，灰度值差异有统计学意义(P < 0.01)。

3 讨论

内源性甲醛是SSAO酶催化内源性胺类物质脱氨产生的高反应性物质，具有神经毒性〔2〕, 诱导肝细胞半胱天冬酶(caspase)活化，启动肝细胞凋亡〔6〕; 诱导交联及β淀粉样蛋白形成，进而诱发AD〔2, 3〕。本研究主要有如下发现：(1)浓度依赖性有诱导PC12细胞典型凋亡(Hoechst 33258荧光染色); (2)40 μmol/L甲醛主要诱导凋亡(Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞)，160 μmol/L甲醛主要诱导细胞坏死; (3)明显降低细胞活力(MTT法)，160 μmol/L甲醛组细胞生长抑制率达高峰; (4)甲醛浓度>40 μmol/L时，呈剂量依赖性诱导LDH漏出，iNOS选择性抑制剂AG明显降低甲醛诱导的PC12细胞损伤; (5)甲醛浓度依赖性的增加细胞培养液NO含量的细胞毒性，增加caspase-3和procaspase-3蛋白表达。提示甲醛具有明显的细胞毒性，其机制可能与NOS及caspase-3凋亡途径有关。

过量NO诱导细胞凋亡是脊髓损伤的重要原因，脑内过量释放NO可导致细胞死亡〔7〕。NO生成的关键酶是NOS, iNOS形成的病理性NO是诱导内皮细胞凋亡的主要原因〔8〕。AG明显抑制iNOS活性，改善神经细胞存活率〔9〕。表明iNOS激活是介导甲醛PC12细胞毒性机制。caspase-3是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路〔10, 11〕，甲醛诱导相关基因caspase活化进而导致细胞凋亡〔2, 3〕。NO的供体可开放线粒体通透性转运孔道，释放细胞色素C，激活caspase-3, 导致细胞凋亡〔12〕。本研究发现，甲醛诱导procaspase-3蛋白表达，iNOS抑制剂AG明显的抑制甲醛对procaspase-3激活。提示NO在caspase-3上通过效应蛋白分子procaspase-3诱导PC12细胞凋亡。结果表明，甲醛主要是通过iNOS/NO或激活caspase-3诱导PC12细胞凋亡。

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