戊型肝炎(戊肝，HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的一种非甲非乙型病毒性肝炎。HE在亚洲、非洲和美洲等发展中国家人群中发病率较高，在一些地区可占到急性病毒性肝炎的50%^{〔1, 2〕}。HEV是一种无包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约7.2 kb，有3个开放型读码框(ORF)。目前国际病毒分类委员会(ICTV)暂未对其进行准确分类。Lu L^〔3〕等对Genbank中421个HEV的核苷酸序列进行了分析，HEV主要分为4个基因型，而且具有明显的地域性。

目前有报道, 猪、鹿、犬、鼠、马和鸡等动物体内均检测出了HEV抗体，而且从猪群中分离出的HEV与当地人群中流行的HEV同属一个基因型。因此，戊型肝炎可能为人畜共患的传染病^〔4-7〕。为了解HEV在其他家畜中的流行情况，对武汉地区的小牛、羊感染HEV的情况进行了调查，了解其感染程度以及感染趋势，并将HEV核酸阳性样品接种恒河猴以观察其致病性，为控制HEV在该地区的传播和扩散提供依据。

采集武汉地区小牛血清样本397份和羊血清样本503份。从每头小牛和每只丰中采集约5mL血液样本，2 500 r/min离心25 min，分离血清，并放置-20 ℃保存备用。

HEV抗原酶联免疫检测试剂以及双抗原夹心法检测HEV总抗体的酶联免疫检测试剂(北京万泰公司)检测猴血清中的抗一HEV IgG和IgM抗体的酶联免疫试剂(新加波MP Biomedicals Asia pacific Pte Ltd分司)。

采用HEV抗原酶联免疫检测试剂以及双抗原夹心法检测HEV总抗体的酶联免疫检测试剂，对样本进行HEV抗原以及抗HEV抗体的检测。按试剂说明书的要求进行操作并判定结果。对于HEV抗原S/CO即样品的A值比Cutoff值)值介于1~5之间的样本进行双孔复试，双孔复试均阳性者判为该样本为阳性。

对HEV抗体或抗原检测为阳性的样本用荧光RT-PCR试剂盒(北京金豪公司)进行HEV核酸检测，按照产品说明书进行操作。对荧光RT-PCR检测为HEV核酸阳性者用套式RT-PCR方法进行扩增，其中套式方法所用的引物为HEV ORF2区的简并引物(SEEO1/I1，SEBO1/I1)^〔8〕。检测方法如下：用金豪核酸抽提试剂盒提取HEV核酸，用SuperScript First-Strand Synthesis System将提取的HEY核酸逆转录合成cDNA，具体扩增方法参考文献〔8〕。

取套式RT-PCR阳性产物进行电泳，从电泳胶中切出条带，并用DNA胶回收试剂(北京全式金公司)对DNA片段进行纯化回收，将纯化的产物连接到T3载体(北京全式金公司)上。然后用载体上的测序引物对插入片段进行序列测定。采用DnaStar软件对所获得的基因序列进行比对分析，并画出基因进化树。序列分析所用的ORF2参照序列分别为(括号中为GenBank号)：HEV 1型的代表序列为Moro (AF065061);2型的代表序列为M1(M74506);3型的代表序列01-9913(AF466676);4a亚型的代表序列为Ch87(AJ344171)，4b亚型的代表芋列为Chl81(AJ344188)，4c亚型的代表序列为HE-JAl (AB097812)，4d的代表序列为Tl (AJ272108)，4e亚型的代表序列为：IND-SWl (AF324501)，4g的亚型代表序列为CCC220(ABl08537)，4f亚型的代表序列为HE-JA2(AB082558)。

将HEV核酸阳性样品(编号为羊107)用0.2 μm的滤器进行除菌过滤，分成1.5和1.3 mL 2份样品，其编号分别为WH1和WH2。每只猴子的体重为2 kg左右，在接种前观察2周，并检测抗-HEV IgG和抗-HEV IgM抗体及转氨酶，且HEV抗体均为阴性，转氨酶正常。接种当天留取粪便以及血清样品; 每份样品接种1只猴子。接种后每周采集1次血清以及粪便样品并现场检测血清转氨酶。对采集的血清样品进行HEV抗原、抗HEV IgG和IgM抗体和核酸的检测; 对粪便样品，用含1%BSA的生理盐水将其制成10%的悬液，进行核酸检测。

使用SPSS软件进行统计分析。

武汉地区标本503份羊血清，其HEV抗体阳性率为21.87%(110份)，抗原阳性率为12.33%(62份); 抗原和抗体同时阳性者为2.78%(14份)。对羊血清抗体阳性者中抗体滴度分析显示, 抗体阳性中S/CO值 < 5者为80.91%， > 10者为4.55%，介于5~10者为14.55%。

在503份羊血清样品中，HEV抗原阳性者为62份, 阳性率为12.33%;其中在HEV抗体阴性的393份样品中有48份为HEY抗原阳性，阳性率为12.21%;在抗体阳性但S/CO值 < 10的105份样品中，有12份样品为HEV抗原阳性，阳性率为11.43%;在抗体阳性且S/CO值 > 10的5份样品中有2份为HEV抗原阳性，阳性率为40%。经统计分析，这3部分样本的抗原阳性水平之间差异无统计学意义。

对羊血清抗原阳性者S/CO值分布分析表明，S/CO值 > 10者为3.22%， < 5者为91.93%，介于两者之间者为4.83%。

武汉地区397份小牛血清标本，HEV抗体阳性率为2.02%(8份)，抗原阳性率为0%。对小牛血清抗体阳性者中抗体滴度分析显示，抗体阳性者S/CO值 > 10者为2份， < 5者为5份，介于5~10者为1份。

用荧光RT-PCR试剂对抗体阳性的8份小牛血清以及抗原或抗体阳性的158份羊血清进行HEV核酸检测，结果仅有1份羊血清为HEV核酸阳性，其编号为107。该样品的血清学检测结果为HEV抗原阴性而抗体阳性。

对该样品采用套式RT-PCR进行检测，结果亦为阳性，对其阳性产物进行克隆和测序。序列分析结果显示, 该序列与l型、2型和3型的核苷酸序列的同源性分别为75.6%, 76.7%和76.6%，与4a、4b、4c、4d、4e、4f和4g亚型的同源性分别为85.8%，84.2%，83.2%，84.8%，82.4%，87.1%和86.1%。因此，该序列与4型的同源性较高，应该为4型。基因进化树分析也显示，该序列为HEV 4型，但与已报道的各亚型有所不同。

图 1

图 1 恒河猴WH1的HEV标志物和转氨酶的动态变化

将HEV核酸阳性的羊血清分别以1.3和1.5 mL各静脉接种1只恒河猴，接种后观察6周，2只猴子均未出现典型的肝炎症状，转氨酶也无明显升高; 血清和粪便中均未检测到HEV核酸; 接种1.5 mL血清样品的WHl猴子其抗-HEV IgG抗体从接种后10 d开始阳转，持续至试验观察截止时间，但其IgM抗体未阳转; 而另1只猴子其IgG和IgM抗体均未阳转。

本研究用ELISA方法检测武汉地区小牛和羊血清中HEV抗原和抗体情况，并对抗体或抗原阳性的样本进行核酸检测。结果显示。503份羊血清中HEV抗体阳性率为21.87%，抗原阳性率12.33%;抗原和抗体同时阳性者为2.78%。而小牛血清中HEV抗体阳性率为2.02%，无抗原阳性者。由此可见，在同一地区小牛感染HEV的概率明显低于羊感染HEV的概率。但对于本地区猪的HEV感染率^〔9〕，小牛和羊的感染率要明显偏低。

在羊和小牛血清中虽然有一定比例的样品为HEV抗体阳性，但其S/CO值大部分 < 10，比猪群中HEV抗体滴度普遍较低，这也可能说明猪比羊和小牛对HEV更敏感。在小牛血清中无HEV抗原阳性者，而羊血清中抗原的阳性率为12.33%，但抗原阳性者其核酸均为阴性，而在对猪血清检测时两者符合率较高，可达32%左右^〔10〕。分析其原因：(1) 抗原阳性的样本中S/CO值 < 5者达到91.93%，即大部分阳性样品的S/CO值均 > 5，S/CO值 > 10者仅为3.22%，如此则不能排除有部分的样品为假阳性，至少阳性很弱; (2) 可能是由于HEV核苷酸序列变异较大，不同引物的检出情况不同，一套引物甚至简并引物也很难检出HEV的所有基因型以及亚型。因此，要提高HEV核酸检出率，可采用几种引物分别进行检测。

在所有样本中只检出了1份为HEV核酸阳性，对其核酸阳性产物的序列分析显示该序列为HEV 4型，可能为一新的亚型。将该样品进行无菌处理后接种恒河猴，结果无明显感染症状。分析其可能原因，一方面可能是因为病毒载量较低，攻毒量不够，不足以引起受试动物感染HEV，并引发肝炎临床症状。1.5 mL的攻毒量可引起抗体变化，但1.3 mL攻毒量却不足以引起抗体的变化; 另一方面，从羊中分离的HEV能否在猴体中诱发典型的肝炎症状还不确定，仍需要进一步确认。